[发明专利]检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒及其制备方法。

背景技术

牛结核病（Bovine tuberculosis）主要是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种慢性传染病，它可以传染给人，人饮用消毒不彻底的受结核病菌污染的牛奶或直接接触患结核病的病牛，使人感染患结核病。近十几年来，世界各国都采取了各种措施来控制和消灭牛结核病，目前只在少数发达国家已消灭了牛结核病，在大多数发展中国家仍然有牛结核病的发生，我国也不例外,虽然我国一直采用“检疫和捕杀阳性牛”的防制办法，但至今仍未能消灭牛结核病。因此，控制和消灭牛结核病是我国当今的一件大事，具有重要的经济和公共卫生意义。一直以来，检测牛结核病的方法用得最多的方法是牛结核菌素皮内变态反应(purified protein derivative,PPD)检测法，其缺点是费时、费力，结果易受人为和其它因素如怀孕等的影响，虽然其结果不是很准确，但是在我国还是作为检测牛结核病的标准。目前急需快速、准确、简便的检测牛结核病的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、准确、简便、适于临床大批量检测的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒，以便于牛分枝杆菌抗体的临床检测。

本发明所提供的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、抗牛IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、封闭液、底物液和终止液，其中，所述包被酶标板是用氨基酸序列是SEQ ID No.2的牛分枝杆菌抗原包被固相载体得到的。

其中，SEQ ID No.2由100个氨基酸残基组成。

上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，所述固相载体可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。在本发明的一个实施例中，所述固相载体具体为聚苯乙烯。

上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，所述包被酶标板可按照包括如下步骤的方法制备：将氨基酸序列是SEQ ID No.2的牛分枝杆菌抗原用包被缓冲液配制成8μg/mL的溶液作为包被液加入固相载体中，37℃温育1h后，在4℃放置8-10小时；然后对所述固相载体进行封闭得到包被酶标板。

上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，每升所述包被缓冲液可按照如下方法配制：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加水定容至1000mL，调pH值到9.6。

上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，所述牛分枝杆菌抗原是将编码序列是SEQ ID No.1的第32-334位核苷酸所示的DNA分子在大肠杆菌中表达得到的蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由100个核苷酸组成。

上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，所述DNA分子通过重组表达载体pET32a-MBA导入所述大肠杆菌，所述重组表达载体pET32a-MBA是将pET32a（+）中的EcoR I和HindⅢ识别位点间的小片段替换为所述DNA分子得到的重组表达载体。

上述检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒中，所述抗牛IgG酶标二抗是以辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG；

所述阴性标准血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阴性牛的血清；

所述阳性标准血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阳性牛的血清；

所述洗涤液是含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；每升所述含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液由NaCl8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O2.9g，吐温-20500uL，加蒸水定容至1000mL，调pH值到7.4制成；

所述稀释液是1%小牛血清白蛋白（BSA）溶液；

所述封闭液是5%脱脂奶粉溶液；