[发明专利]一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法

权利要求书

1.一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，其特征在于，包括种球预处理和消毒灭菌、鳞片接种、脱分化培养、再分化形成脱毒幼苗以及幼苗的驯化及移栽，其中，所述种球预处理和消毒包括将选用的种球置于4℃下低温保存30天；所述脱分化过程采用蓝光照射；所述脱分化培养中所用的培养基，其中生长素类物质和细胞分裂素类物质浓度比为1:1；所述再分化过程中，愈伤组织开始形成嫩芽后，向再分化培养基表面加入1.5mg/L吲哚丁酸或2,4,5-T 1-2ml。

2.根据权利要求1所述的一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)种球预处理和消毒灭菌

选用外表无损伤的种球，用保鲜膜包裹郁金香种球，置于4℃中预冷处理30天，将经过低温保存的种球自然升温至室温，剥去种球外层表皮，用无菌解剖刀切去黄化老死的部分，然后用洗洁精洗净表面污物，自来水冲洗20分钟，充分洗净残留的洗洁精，然后首先经过重量比为0.1%的升汞中消毒10分钟，再浸泡在体积比为75%的酒精中灭菌13秒，取出后用无菌水反复冲洗3次，每次4分钟；

2)鳞片接种

用无菌解剖刀切除种球尖端开口部分，再纵切种球，取内层鳞片为材料，用灼烧灭菌后的刀片将鳞片切割成按大小均为1mm2的小块，按凸面向上进行接种，将小碎片移入到灭菌后的培养基中；

3)脱分化培养

将接有小鳞片的培养基繁殖在人工气候箱中进行脱分化培养，具体培养条件：温度设定为27℃，相对湿度设定为80%，采用蓝光进行照射，光照强度设置为300lux，光照12h/d，处理8-12天后，形成愈伤组织；

4)再分化形成脱毒幼苗

将步骤3）脱分化培育出的愈伤组织转移到再分化培养基中培养，再分化培养在人工气候箱中进行，具体培养条件：温度设定为25℃，相对湿度设定为80%，光照强度设置为1700lux，光照12h/d；在再分化培养基中培养2周后，待愈伤组织开始形成嫩芽后，向再分化培养基表面加入1.5mg/L吲哚丁酸或2,4,5-T 1-2ml，继续在相同的条件下继续培养直至形成胚状体、幼苗；

5)幼苗的驯化及移栽

待郁金香幼苗形成后，将幼苗移栽在灭菌处理后的营养土中，从生态气候箱中移到无菌光照培养架上，再逐渐移到实验外环境中，待其能正常生长之后，将其移栽到土壤中正常培养。

3.根据权利要求2所述的一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，其特征在于，所述的脱分化培养所用的培养基为MT培养基，其配方及配制方法为： NH₄NO₃ 为780 mg/L，KNO₃为1000 mg/L，CaCl₂·2H₂O为350 mg/L，MgSO₄·7H₂O为370 mg/L，KH₂PO₄为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H₃BO₃为6.2 mg/L，MnSO₄·4H₂O为22.3 mg/L，ZnSO₄·7H₂O为8.6 mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O为0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O为0.023 mg/L，CoCl₂·6H₂O为0.023 mg/L，FeSO₄·7H₂O为28.1 mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸吡哆醇0.3 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，生长素类物质1.0-2.5mg/L，细胞分裂素类物质1.0-2.5mg/L，蔗糖25g/L，琼脂条10g/L，pH为6.6。

4.根据权利要求3所述的一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，其特征在于，所述生长素类物质为吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸，萘乙酸、萘乙酸钠、萘氧乙酸、萘乙酰胺、2,4-D、2,4,5-T、4-碘苯氧乙酸或2,4-D丁酯中的至少三种以上的组合。