[发明专利]一种热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及一种热稳定性改良的木聚糖酶突变体XynAS9-mV81P/G82E及其基因和应用。

背景技术

木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanases，EC3.2.1.8)是一类重要的工业用酶，降解木聚糖成低聚糖和木糖的一类酶的总称。主要以内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-糖苷键，生成低聚木糖和木糖，是半纤维素水解酶系中最关键的水解酶之一，目前所克隆的木聚糖酶大多属于F/10和G/11家族，且第十家族的木聚糖酶较第十一家族的木聚糖酶具有底物特异性低、水解速度快、水解产物聚合度低等优势，因此在工业上具有重要的应用价值。近几年来木聚糖酶已经在饲料、制浆造纸、食品、能源等行业中得到广泛应用，尤其是在工业造纸上的应用。但是目前大多木聚糖酶的最适温度为45-55℃，且热稳定性差，不能满足纸浆酿造中的要求，并且高温木聚糖酶或耐热酶具有降低酶制剂的成本，提高反应催化效率，降低反应能耗，降低了杂菌的污染及对化学变性剂及相关金属利息具有较高的耐受力。基于此寻找有效途径和手段，提高木聚糖酶在高温环境中的稳定性及催化活性已成为国内木聚糖酶工业的当务之急。

随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用定向进化和理性设计的手段对酶分子进行人工进化和改造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，已有许多学者运用这项技术成功对蛋白的热稳定性进行了改造，本发明应用定点突变的方法改造木聚糖酶，分别获得木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E和木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E/D185P/S186E，将木聚糖酶XynAS9-m的最适温度提高了20℃，Tm值提高了7℃，扩大了其在工业上的应用。

发明内容

本发明的目的是通过定点突变的方法对木聚糖酶进行改造，使改造后的木聚糖酶XynAS9-m突变体在耐受性上性质更加优良。

本发明的另一目的是提供编码上述木聚糖酶XynAS9-m突变体的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述木聚糖酶XynAS9-m突变体基因的重组载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，其含有如前所述的木聚糖酶XynAS9-m突变体的基因或如前所述的重组载体。

本发明对链霉菌来源的木聚糖酶XynAS9-m基因进行定点突变，该木聚糖酶的成熟蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的。

SEQ ID NO.1

1    MFRHHPTRGR RTAGLLAAAL ATLSAGLTAV APAHPARADT ATLGELAEAK

51   GRYFGSATDN PELPDTQYTQ ILGSEFSQIT VGNTMKWQYT EPSRGRFDYT

101  AAEEIVDLAE SNGQSVRGHT LVWHNQLPSW VDDVPAGELL GVMRDHITHE

151  VDHFKGRLIH WDVVNEAFEE DGSRRQSVFQ QKIGDSYIAE AFKAARAADP

201  DVKLYYNDYN IEGIGPKSDA VYEMVKSFKA QGIPIDGVGM QAHLIAGQVP

251  ASLQENIRRF ADLGVDVALT ELDIRMTLPR TAAKDAQQAT DYGAVVEACL

301  VVSRCVGITV WDYTDKYSWV PSVFPGQGAA LPWDEDFAKK PAYHAIAAAL

351  NGGSPAPGGN CTATYRVTSQ WQGGFTAEIT VGNDHTAPIT GWTVTWTLSS

401  GQSISHMWNG NLTVNGQDVT VRDVGYNGTL GGNGSTTFGF QGEGVADTPA

451  DVTCTPGRPS GTSA

SEQ ID NO.2

1    ATGTTCCGCC ACCACCCGAC CCGAGGCCGC CGCACGGCCG GCCTCCTCGC GGCAGCGTTA

61   GCAACCCTGT CGGCCGGCCT GACCGCGGTT GCGCCCGCTC ATCCGGCCCG CGCCGACACC

121  GCCACCCTGG GCGAACTGGC CGAGGCCAAG GGCCGTTACT TCGGCTCCGC CACGGACAAC