[发明专利]一种树木SNP位点基因型检测方法

权利要求书

1.一种树木SNP位点基因型检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

步骤S1，采用扩增引物对树木的全基因组DNA进行PCR扩增，得到长度不大于500bp的PCR扩增产物，其中所述扩增引物具有生物素标记；

步骤S2，对所述步骤S1中得到的PCR扩增产物进行单链制备，得到5’端有生物素标记的DNA单链，所述DNA单链包含多个待测位点；

步骤S3，利用测序引物对所述步骤S2得到的所述DNA单链进行焦磷酸测序分析，其中序列读取长度为20～50bp，混合酶用量为390～395μl/plate，荧光底物用量为390～395μl/plate，得到分型结果。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，且所述正向扩增引物或者所述反向扩增引物具有所述生物素标记。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测位点中第一个待测位点靠近所述测序引物的3’末端最后一个碱基。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中所述PCR扩增的体系为25μl，由20ng全基因组DNA、0.8U Taq酶、0.2mM dNTPs、10×PCR缓冲液以及50ng正向引物和50ng反向引物和超纯水组成。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中所述PCR扩增包括：

步骤S11，将所述全基因组DNA依次在95℃下预变性6min、95℃下变性30s，得到变性产物；

步骤S12，将所述变性产物在50～60℃下退火30s，得到退火产物；

步骤S13，将所述退火产物在72℃下延伸1min；

步骤S14，将所述步骤S11至所述步骤S13重复35～45次，且最后一次的所述步骤S13持续10min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中所述DNA单链制备包括：

步骤S21，将所述PCR扩增产物与结合缓冲液、琼脂糖珠进行混合，形成混合物；

步骤S22，将所述混合物进行化学变性，得到具有所述生物素标记的所述DNA单链。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述树木为小叶杨，所述待测位点为CBF2基因的SNP1位点和SNP2位点，所述SNP1位点位于所述CBF2基因的68bp处，所述SNP2位点位于所述CBF2基因的95bp处，其中CBF2基因的碱基序列为SEQ ID NO：1。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，其中所述正向扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:2，所述反向扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:3，且所述正向扩增引物采用所述生物素进行标记。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述测序引物的碱基序列为SEQ ID NO:4，所述SNP1位点的基因型为T和C，所述SNP2位点的基因型为A和G，且所述SNP2位点与所述测序引物3'末端最后一个碱基之间具有一个碱基。