[发明专利]一种树木SNP位点基因型检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体而言，涉及一种树木SNP位点基因型检测方法。 

背景技术

焦磷酸测序分型技术主要是利用了核酸链延伸时，每添加一个核苷酸残基，就会释放一个焦磷酸基团（PPi），而PPi与腺苷酰硫酸（APS）在酶的催化下，会生成等量的ATP。ATP驱动荧光素酶介导荧光素转化为氧化荧光素，释放出强度与ATP量成正比的可见光信号。因此，由可见光信号的有无和强弱，可以判断该核苷酸残基是否连接到了核酸链末端以及连接的数量。所以通过分别依次向以待测序DNA单链为模板的引物杂交延伸体系中加入硫代三磷酸腺苷（dATPS，替代dATP）、三磷酸鸟苷（dGTP）、三磷酸胞苷（dCTP）和三磷酸胸苷（dTTP）四种中的一种，通过检测是否有可见光产生以及可见光强度的大小，可以判断延伸的核苷酸残基类型以及数量，从而达到对模板DNA单链进行测序以及基因型类型检测的目的。 

目前，焦磷酸测序分型技术主要应用于人类医学以及动物研究领域，植物领域极少使用，尤其是树木领域则是空白。 

发明内容

本发明旨在提供一种树木SNP位点基因型检测方法，弥补了焦磷酸测序分型技术在树木领域的空白。 

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种树木SNP位点基因型检测方法，该检测方法包括：步骤S1，采用扩增引物对树木的全基因组DNA进行PCR扩增，得到长度不大于500bp的PCR扩增产物，其中扩增引物具有生物素标记；步骤S2，对步骤S1中得到的PCR扩增产物进行单链制备，得到5’端有生物素标记的DNA单链，DNA单链包含多个待测位点；步骤S3，利用测序引物对步骤S2得到的DNA单链进行焦磷酸测序分析，其中序列读取长度为20～50bp，混合酶用量为390～395μl/plate，荧光底物用量为390～395μl/plate，得到分型结果。 

进一步地，上述扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，且正向扩增引物或者反向扩增引物具有生物素标记。 

进一步地，上述待测位点中第一个待测位点靠近测序引物的3’末端最后一个碱基。 

进一步地，上述步骤S1中PCR扩增的体系为25μl，由20ng全基因组DNA、0.8U Taq酶、0.2mM dNTPs、10×PCR缓冲液以及50ng正向引物和50ng反向引物和超纯水组成。 

进一步地，上述步骤S1中PCR扩增包括：步骤S11，将全基因组DNA依次在95℃下预变性6min、95℃下变性30s，得到变性产物；步骤S12，将变性产物在50～60℃下退火30s，得到退火产物；步骤S13，将退火产物在72℃下延伸1min；步骤S14，将步骤S11至步骤S13重复35～45次，且最后一次的步骤S13持续10min。 

进一步地，上述步骤S2中DNA单链制备包括：步骤S21，将PCR扩增产物与结合缓冲液、琼脂糖珠进行混合，形成混合物；步骤S22，将混合物进行化学变性，得到具有生物素标记的DNA单链。 

进一步地，上述树木为小叶杨，待测位点为CBF2基因的SNP1位点和SNP2位点，SNP1位点位于CBF2基因的68bp处，SNP2位点位于CBF2基因的95bp处，其中CBF2基因的碱基序列为SEQ ID NO：1。 

进一步地，上述扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，其中正向扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:2，反向扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:3，且正向扩增引物采用生物素进行标记。 

进一步地，上述测序引物的碱基序列为SEQ ID NO:4，SNP1位点的基因型为T和C，SNP2位点的基因型为A和G，且SNP2位点与测序引物3'末端最后一个碱基之间具有一个碱基。 

本发明的技术方案利用了树木基因杂合度高、DNA序列多态性丰富的特点，将测序长度由现有技术中的20bp延长到20～50bp，从而使得一次测序反应得到更多的位点基因型信息；同时将混合酶用量和荧光底物用量均由现有技术中的588μl/plate减少至390～395μl/plate，节约了三分之一的用量，因此在保证了检测结果准确性的基础上降低了实验成本。 

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 

图1示出了实施例1的测序分型结果的基因型峰图。 

具体实施方式