[发明专利]一种试剂盒以及安氏隐孢子虫的检测方法

权利要求书

1.一种试剂盒，其特征在于：包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和预先处理的安氏隐孢子虫阳性模板，所述的LAMP引物包括外引物、内引物及环引物；

所述的外引物是F3和B3；

所述的内引物是FIP和BIP；

所述的环引物是LF和LB；

其中引物的序列分别为：

F3  CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA

B3  CATACATTGCTGCCCAGA

FIP GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC

BIP GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG

LF CCAGGAGGACATTCAGGGTT

LB GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG；

各组分的份量为：

F3                               100μl

B3                               100μl

FIP                              100μl

BIP                              100μl

LF                               100μl

LB                               100μl

2×反应缓冲液                12.5μl

Bst DNA聚合酶               60μl

荧光目视检测试剂            0.1ml

超纯水                           1ml

安氏隐孢子虫阳性模板      100μl；

所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的安氏隐孢子虫阳性模板预先处理步骤是取待检牛的新鲜粪便20.0~50.0g，置灭菌烧杯充分搅匀，称取搅拌后的粪便样本180~220mg于2ml离心管中，反复冻融3~5次，按粪便基因组DNA提取说明书提取。

4.安氏隐孢子虫的检测方法，其特征在于：使用权利要求1所述的试剂盒，具体检测步骤如下：

1）LAMP引物的设计与合成；

2）LAMP反应体系的建立； 

3）LAMP扩增，判断样品中菌种的种类。

5.根据权利要求4所述安氏隐孢子虫的检测方法，其特征在于：所述的LAMP反应体系以25μl计：

2×反应缓冲液                            12.5μl

F3                                            5pmol

B3                                            5pmol

FIP                                           40pmol

BIP                                          40pmol

LF                                            20pmol

LB                                            20pmol

安氏隐孢子虫阳性模板                  2μl

超纯水                                       补足25μl。

6.根据权利要求5所述安氏隐孢子虫的检测方法，其特征在于：所述的判断样品菌株的方法采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测。