[发明专利]一种试剂盒以及安氏隐孢子虫的检测方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种安氏隐孢子虫的检测方法以及该方法所采用的试剂盒。

背景技术

隐孢子虫(Cryptosporidium Tyzzer)是一种危害严重的机会性致病人兽共患胃肠道原虫，卵囊污染水源、食物等造成隐孢子虫病暴发流行，宿主广泛，可感染包括人在内的多种动物。在绝大部分地面水、受地面水污染的浅井和防护条件较差的深井水、处理不良的自来水、处理或未处理过的排放污水、经过滤的游泳池水中，均可检出隐孢子虫卵囊（沈玉娟等，2005）。安氏隐孢子虫(Cryptosopridium andersoni)主要感染断奶犊牛、育成牛和成年牛（Paul等，2009），感染奶牛后可引起奶牛产奶量下降，体质变弱，是影响奶牛业发展的重要致病因素之一（任文陟等，2010）。

传统检测方法如粪便浓集、改良抗酸染色和免疫荧光染色法等检测卵囊步骤繁琐，敏感性低，许多干扰因素如酵母、饲料颗粒以及肠道内容物等均影响检测效果（陈甫等，2006）。而目前使用最普遍的分子生物学检测隐孢子虫方法为Xiao等建立的Nest-PCR -RFLP（Xiao等，1999），特点是通用性好，可检测目前发现的所有隐孢子虫种类，但需要两轮PCR以及酶切鉴定的过程方能定种，耗时较长。鉴于安氏隐孢子虫的危害性，急需建立一种快速检测方法。

Notomi等在2000年报道了一种新的DNA扩增技术-环介导等温扩增（简称LAMP）技术，该技术具有方法简单、快速、特异性强的特点，而且不需要PCR仪，肉眼可判断结果及反应时间短等优点。该技术中所用到的LAMP方法检测需1小时后加入染料才能判断结果，反应中加入的荧光染料syber-green，需采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，存在开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染，缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素，不能对检测结果做出准确的判定，这已成为限制LAMP技术进一步发展的一大难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测安氏隐孢子虫的方法，公开一种安氏隐孢子虫的检测方法以及该方法所采用的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和预先处理的安氏隐孢子虫阳性模板；所述的LAMP引物包括外引物、内引物及环引物；

所述的外引物是F3和B3；

所述的内引物是FIP和BIP；

所述的环引物是LF和LB；

其中引物的序列分别为：

F3   CAGGTTTTACATTTTCAGGGAA

B3  CATACATTGCTGCCCAGA

FIP GCATGTTCCATTCTCCAATACAGTCAGTCTGATACTGCACCTCC

BIP GCAAGTAGATACTATATGCCCACCTTGGACATATTTTGTTTGCTGG

LF CCAGGAGGACATTCAGGGTT

LB GAGGAGGGAAATAGATGTGTCCAG；

各组分的份量为：

F3                       100μl

B3                       100μl

FIP                      100μl

BIP                      100μl

LF                       100μl

LB                       100μl

2×反应缓冲液             12.5μl

Bst DNA聚合酶            60μl

荧光目视检测试剂          0.1ml

超纯水                    1ml

安氏隐孢子虫阳性模板      100μl；