[发明专利]检测纤维二糖酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域中检测酶抑制剂的方法，尤其涉及一种检测纤维二糖酶抑制剂的方法。

背景技术

纤维素酶是由能降解木质素的微生物分泌的一种多组分复合酶，它包括内切型葡聚糖酶（EC3.2.1.4，也称CX酶、CMC酶）、外切型葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也称C₁酶、微晶纤维酶）和纤维二糖酶（EC3.2.1.21，也称β-葡萄糖苷酶）三种主要组分。普遍认为在将天然纤维素降解成葡萄糖的过程中，必须依靠这三种组分的协同作用才能完成。纤维素大分子首先在C₁酶和C_X酶的作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成葡萄糖。在利用纤维素酶制剂水解纤维素的过程中，常常由于纤维二糖酶的活力很低造成纤维二糖的累积，而纤维二糖又会对纤维素酶的催化作用形成强烈的反馈抑制。因此在纤维素酶解过程中提高纤维二糖酶的活力意味着提高纤维素水解效率和葡萄糖产量。

实际应用中纤维二糖酶的活性会受到环境因素的抑制，例如土壤中的汞、铜等重金属会通过富集作用进入植物体内，而木质素降解功能微生物在处理这些含重金属的植物残体时，由于这些重金属存在，会抑制木质素降解功能微生物的生物活性，并且这些重金属能使纤维二糖酶的必需基团或活性部位的性质和结构发生改变，导致酶活性降解或丧失，从而抑制纤维素的降解效率。因此一种特异性高效检测纤维二糖酶活性抑制剂的方法能有效提高纤维二糖酶的实际应用价值。

目前，检测纤维二糖酶活性抑制剂的方法普遍是基于纤维二糖酶活性测定方法，其中Barush和Swiain法是以水杨苷为酶反应底物，检测水解后产生的极微量的葡萄糖，反应易受干扰，且检测灵敏度不高；荧光法灵敏度高且快速，但是由于实验过程操作复杂，且重现性不好，现在应用不多；比色法是以对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）为酶底物，检测底物水解后释放出来的对硝基苯酚，而对硝基苯酚是一种很难被生物降解的、危害环境的高毒性有机物。因此，研究一种简便高效且对环境无害的纤维二糖酶抑制剂检测方法是亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种更加快速、灵敏、且对环境无害、成本低廉的检测纤维二糖酶抑制剂的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种检测纤维二糖酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：将一种可用于检测纤维二糖酶抑制剂的纳米金探针溶液加入含待测物质的纤维二糖酶溶液中，所述纳米金探针溶液与所述纤维二糖酶溶液的体积比为20∶1，其中每20体积的纳米金探针溶液中含有2～4体积的纳米金探针浓缩液（所述浓缩液为纳米金探针制备时高速离心后的含纳米金探针沉淀的浓缩液），将检测温度控制在30℃～35℃，检测pH值控制在4.0～4.5，待纳米金探针反应完全后（一般至少反应10min），检测含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，得到吸收峰在620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A620/A520，设为A₂；同等条件下，即纳米金探针溶液与纤维二糖酶溶液的体积比、检测温度、检测pH值、反应时间等条件均相同的情况下，将所述纳米金探针溶液加入不含待测物质的纤维二糖酶溶液中，检测不含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，得到吸收峰在620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值A620/A520，设为A1；比较含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化（以A₂为代表）和不含待测物质的溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化（以A₁为代表）的大小，即可判断待测物质是否为纤维二糖酶抑制剂（定性检测）；

当A₂＜A₁时，表明待测物质为纤维二糖酶抑制剂，所述纤维二糖酶抑制剂对纤维二糖酶活性的抑制率计算方程为：