[发明专利]一种甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法，属于生物工程技术领域。 

背景技术

甘氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酸（Glycyl-L-Histidyl-L-Lysine，GHK）是1973年Pickart等人首先从人血浆中分离得到的一种三肽，其分子式为C₁₄H₂₄N₆O₄、分子量为340.38，GHK的结构式如下： 

甘氨酰组氨酰赖氨酸能增加正常肝细胞的存活率及促进肝癌细胞的生长，并刺激这些细胞的DNA和RNA的合成，因此被称为肝细胞生长因子。GHK以及GHK与二价铜离子形成的络合物（GHK-Cu）还可促使神经细胞、免疫相关细胞和肾小球细胞的生长、分裂和分化。GHK-Cu可以在纤维原细胞培养液中促进或抑制金属蛋白酶的合成。GHK和GHK-Cu具有的多种生物活性使它们在包括皮肤移植、烧伤等治疗上有着广泛的应用前景，GHK含量的高低在其发挥生理功能时具有重要的作用。 

甘氨酰组氨酰赖氨酸是含有两个肽键的寡肽，其含量的测定可依据多肽及蛋白质含量的测定方法，如双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法等。但双缩脲法灵敏度差，Folin-酚试剂法受到酚类物质、柠檬酸及硫酸铵的干扰，紫外吸收法受到多种有机物（如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等）的干扰。上述方法都是将多肽分子作为一个单元参与反应，对于不同结构的多肽，其测定结果会有较大的差别。 

甘氨酰组氨酰赖氨酸的纯度检测有采用高效液相色谱法（HPLC）的报道，如彭小三（南京大学硕士论文，2003）在进行甘氨酰组氨酰赖氨酸的液相合成及其酶促降解研究时，用液相合成法合成了GHK，并用HPLC检验其纯度，得到1个单峰，证明合成物中只含有GHK，但没有测定其含量。HPLC法虽然具有速度快、分辨率高、灵敏度高等优点，但也具有分析成本高、容量小、流动相消耗大、仪器设备价格昂贵及日常维护费用高等缺点。在实际工作中，大批量GHK样品的含量测定会受时间、经费或仪器设备条件的限制，因而需要采用操作简便、测定快速、成本低、灵敏度高的GHK含量测定方法。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种操作简便、测定快速、成本低、灵敏度高的甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法。 

经研究发现，常用的酸碱指示剂甲基橙可与GHK反应形成一种复合物，该复合物的形成会使溶液的颜色发生变化，因而推断可以通过测定甲基橙的含量来确定GHK的含量。甲基橙又名对二甲基氨基偶氮苯磺酸钠，是一种阴离子染料，其分子式为C₁₄H₁₄N₃SO₃Na，其结构式如下： 

甲基橙水溶液的变色范围为：pH小于3.1时，甲基橙呈红色；pH为3.1～4.4时，则呈橙色；pH大于4.4时，甲基橙呈黄色。据测定甲基橙的最大吸收峰对应波长为465nm。 

本发明的技术方案如下： 

一种甘氨酰组氨酰赖氨酸含量的测定方法，步骤如下： 

（1）取甲基橙标准溶液，分别与不同浓度的GHK标准溶液进行反应，反应后的标准反应液经分光光度计检测吸光度值，以吸光度值为纵坐标、标准反应液中剩余的甲基橙浓度值为横坐标，制作甲基橙溶液标准曲线； 

（2）取待测GHK样品称重后，获得待测GHK样品质量，将待测GHK样品配制待测GHK样品溶液，然后将待测GHK样品溶液与甲基橙标准溶液进行反应，反应后的待测反应液经分光光度计检测吸光度值，根据步骤（1）制得的甲基橙溶液标准曲线，获得反应后剩余的甲基橙摩尔浓度，然后根据如下公式计算GHK的摩尔浓度： 

反应消耗的甲基橙摩尔浓度（mmol/L）=反应前甲基橙标准溶液的摩尔浓度（mmol/L）－反应后剩余的甲基橙摩尔浓度（mmol/L） 

GHK摩尔浓度（mmol/L）=反应消耗的甲基橙摩尔浓度（mmol/L）÷2 

再根据如下公式计算GHK质量： 

GHK质量（mg）=340.38×GHK摩尔浓度值 

最后，根据如下公式计算甘氨酰组氨酰赖氨酸含量： 

甘氨酰组氨酰赖氨酸含量（%）=（GHK质量÷待测GHK样品质量）×100%。 

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的具体操作步骤如下：