[发明专利]杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组份：（1）荧光定量PCR引物HSHRV-2F、HSHRV-2R和探针HSHRV-2 probe；（2）荧光定量PCR反应液；（3）阳性对照；（4）阴性对照；其中，所述荧光定量PCR引物和探针的核苷酸序列如下：

HSHRV-2F：5'-CACCAGTCATATCAATCC-3'              （SEQ ID NO.3）；

HSHRV-2R：5'-CGGACTTAAACCTCATTC-3'             （SEQ ID NO.4）；

HSHRV-2 probe：5'-ACCTCTCCGCACATTGACATCT-3'     （SEQ ID NO.5）。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照，其制备方法包括以下步骤：提取杂交鳢弹状病毒总RNA，反转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物作为阳性对照；其中，引物P1的核苷酸序列为5'-CGCGGATCCATCATGAAATCAATCATTGCACT-3'（SEQ ID NO.1），引物P2的核苷酸序列为5'-CATCTGCAGAATTGATACTGCTGCAAAGGG-3'（SEQ ID NO.2）。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：将扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量PCR反应液含有Premix Ex Taq^TM，ROX Reference Dye Ⅱ。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为ddH₂O。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的5'端标记荧光染料FAM，3'端标记淬灭基团BHQ。

7.杂交鳢弹状病毒的检测方法，包括以下步骤：

1)提取待检样本的总RNA，反转录获得cDNA；

2)以cDNA为模板，用杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行特异性RT-PCR扩增；

3)反应结束，根据待检样本的Ct值判断其为杂交鳢弹状病毒阳性或阴性；

其中，杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒如权利要求1～6任意一项所述。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2）的扩增反应体系为：10μL的Premix Ex Taq^TM；0.4μL的50×ROX Reference Dye Ⅱ；0.3μmol/L的引物HSHRV-2F；0.3μmol/L的引物HSHRV-2R；0.24μmol/L的探针HSHRV-2 probe；2μL的cDNA模板；加ddH₂O补足体积至20μL。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述步骤2）的扩增反应程序为：94℃ 2min； 94℃ 15s，55℃15 s，72℃ 20s，5个循环；94℃ 5s，55℃ 35s ，40个循环。