[发明专利]杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病原微生物的检测领域，特别涉及杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。 

背景技术

杂交鳢（Channa maculata♀×C. argus♂）是以斑鳢为母本，乌鳢为父本，通过杂交获得的子一代，杂交鳢综合了亲本的优点，在实际生产过程中具有生长速度快、抗逆性强、成活率高、耐运输、易驯食人工配合饲料等优点。由于杂交鱧的养殖经济效益明显，近年在全国范围内养殖规模不断扩大，已逐步替代乌鳢、斑鳢等鱧科鱼类成为主要的养殖品种。然而，2012年的7月以来，广东省的广州、佛山、中山、清远等多个地方养殖场暴发杂交鳢大规模死亡的流行性疾病，造成巨大的经济损失。杂交鳢弹状病毒病是近年新发的流行性疾病，该病发病迅速、死亡率高，给鳢科鱼类养殖业造成了重大的经济损失，目前还没有该病的致病机理和流行病学研究相关的报道。由于发病初期鱼体没有明显的表观症状，快速准确地诊断以及病毒病原的定量检测对于该病的预警与防控技术研究十分重要。 

本实验室从细菌学和病毒学两方面对患病鱼进行分析，确认引起养殖鱼暴发性死亡的疾病为弹状病毒病，其病原为杂交鳢弹状病毒(Hybrid Snakehead rhabdovirus，HSHRV)。 

弹状病毒为线性负义单链RNA病毒，病毒粒子长100～430nm，直径45～100nm，形态似棒状或子弹状，通常具有5种主要结构蛋白（L，G，N，P，M）。弹状病毒科包括175种以上的成员，可感染脊椎动物、无脊椎动物及植物。鱼类弹状病毒因感染宿主广、毒株种类多、毒力强，严重危害各种淡水和海水鱼。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有二十多种，其中危害较大的有鲤春病毒血症病毒（SVCV）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、牙鲆弹状病毒（HRV）和鳜鱼弹状病毒（SCRV）等。弹状病毒科分为6个属，即水泡性病毒属（Vesiculovirus）、狂犬病毒属（Lyssavirus）、短暂热病毒属（Ephemerovirus）、诺拉弹状病毒属（Novirhabdovirus）、质型弹状病毒属（Cytorhabdovirus）和细胞核弹状病毒属（Nucleorhabdovirus）。HSHRV是弹状病毒科水泡性病毒属成员，与20世纪八十年代国外报道的诺拉弹状病毒属的乌鳢弹状病毒（SHRV）亲缘关系较远，二者全基因核苷酸序列同源性仅为45.3%；与SCRV亲缘关系较近，全基因核苷酸序列同源性高达94.9%。本实验室研究发现引起广东省杂交鳢死亡的HSHRV主要流行株为C1207株，该毒株能在多种鱼类细胞中复制，人工感染杂交鱧死亡率高达90%。为了及早发现养殖鱼类是否被HSHRV感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。 

目前，传统病毒病诊断需进行病毒分离，细胞转染、电镜观察以及普通PCR检测等方法，缺乏可对病毒进行快速、准确、定量分析的检测预警方法。荧光定量PCR方法具有操作简单、快速，不易出现假阳性，随时对扩增产物进行精确定量分析等优点，正逐渐应用于病原微生物的检测与研究中。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。 

本发明所采取的技术方案是： 

杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组份：（1）荧光定量PCR引物HSHRV-2F、HSHRV-2R和探针HSHRV-2 probe；（2）荧光定量PCR反应液；（3）阳性对照；（4）阴性对照；其中，所述荧光定量PCR引物和探针的核苷酸序列如下：

HSHRV-2F：5'-CACCAGTCATATCAATCC-3'              （SEQ ID NO.3）；

HSHRV-2R：5'-CGGACTTAAACCTCATTC-3'             （SEQ ID NO.4）；

HSHRV-2 probe：5'-ACCTCTCCGCACATTGACATCT-3'     （SEQ ID NO.5）。

优选的，所述阳性对照，其制备方法包括以下步骤：提取杂交鳢弹状病毒总RNA，反转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物作为阳性对照；其中，引物P1的核苷酸序列为5'-CGCGGATCCATCATGAAATCAATCATTGCACT-3'（SEQ ID NO.1），引物P2的核苷酸序列为5'-CATCTGCAGAATTGATACTGCTGCAAAGGG-3'（SEQ ID NO.2）。