[发明专利]快速获取鹅铁蛋白重链基因编码区序列及定量检测其表达的方法及其引物

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种快速获取鹅铁蛋白重链基因编码区序列及定量检测其表达的方法及其引物。

背景技术

铁元素是细胞生长、增殖及维持生物机体机能活动所必需的微量元素之一，在细胞DNA合成、电子传递、氧气运输等过程中发挥重要作用。但是，如果铁超载可以潜在诱导氧自由基的生成，导致细胞损伤。因此，细胞铁稳态的维持和调节成为目前铁代谢研究方面的中心环节。铁蛋白（Ferritin）是一种保守性较高的多功能、多亚基蛋白，在维持细胞内铁稳态过程中发挥着双重作用：一方面如果细胞中铁含量增多，铁蛋白会螯合细胞质中的游离铁，细胞内过多的铁被封闭起来，细胞内铁的稳态得以维持，保护细胞免受游离金属的毒性作用；另一方如果当外源铁不足时，被铁蛋白存储的铁可以释放出来以供细胞利用。铁蛋白及其受体对于调控铁摄取、贮存以及维持细胞内正常铁浓度具有重要作用。铁蛋白含有重链亚基（ferrintin heavy chain, FTH）和轻链亚基（ferritin light chain, FTL），FTH负责结合Fe²⁺，催化铁氧化；FTL与铁的长期贮藏有关。研究表明，产蛋期鹅卵巢和肝脏组织FTH的表达水平均显著高于产蛋前期，提示FTH可能对鹅卵巢发育和功能具有重要的调控作用。然而，目前有关鹅FTH基因的结构和功能仍不清楚。

目前用于克隆较长目的基因的常用方法主要包括分段克隆和快速扩增cDNA末端技术（Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE）。分段克隆以目的基因保守区设计多对引物，每对引物所扩增的目的基因片段有重叠，然后将所有分段的片段进行克隆、测序、拼接，获得完整的目的片段。最后再以拼接序列为模板设计一对引物来验证所获得的基因是否为目的基因。RACE技术是基于PCR技术基础之上，分别在cDNA序列的3’末端和5’末端设计特定引物，然后进行克隆，从而获得cDNA全长序列的方法。总之，分段克隆和RACE技术都需要做许多次PCR和克隆工作，操作过程繁琐，工作量大，耗时长，且成本高。

半定量反转录－聚合酶链式反应（Semi-Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, SQRT-PCR）是指将mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，取等量的PCR产物，在同一块琼脂糖凝胶上进行电泳检测，然后通过比较电泳图中目的基因和内参基因条带的光密度值计算目的基因表达量（或拷贝数）的定量检测技术。SQRT-PCR技术采用的PCR反应终点法。因此，现有方法只能在PCR反应结束时，获得目的基因片段拷贝数，不能全程了解定量过程中的变化。由于受到半定量电泳操作的影响、凝胶成像系统和光密度分析的分辨率和准确性的限制，定量结果会出现较大偏差和误差，不能十分准确的检测目的基因表达量。

实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction， QRT-PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光染料（如SYBR Green），随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，这个荧光染料所发出的信号也会随之发生变化，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度的变化来监测产物量的变化，从而可以实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。QRT-PCR技术可以对整个PCR反应进行全程实时监测，因此具有结果可靠、准确性高等优点。

因此，为阐明鹅FTH基因的结构和功能，揭示鹅机体内铁代谢的分子调控机制，提高铁代谢相关研究的效率，降低研究成本、提高结果可靠性和准确性，建立简便、快速获取鹅FTH全长编码区序列及定量检测FTH基因表达的方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于针对上述技术不足提供一种快速获取鹅FTH基因编码区序列的方法，该方法操作简便、成本低、效率高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为。