[发明专利]一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法

权利要求书

1.一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于包含以下步骤：

步骤1、配制转化反应体系，其中底物为甘草总提取物和/或甘草总三萜；

步骤2、向转化反应体系中加入β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂，转化甘草总提取物和/或甘草总三萜中的甘草酸及其类似物生成GAMG，至产物浓度基本恒定；

步骤3、将步骤2中所得的转化发酵液，经过分离纯化得到产品GAMG；

其中步骤2中β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的制备方法为：

步骤（1）、先将能诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶的菌种Penicillium purpurogenum Li-3接入到斜面培养基上，经培养后得斜面种子，其中Penicillium purpurogenum Li-3的保藏号为CGMCCNo.5446；

步骤（2）、将步骤（1）所得的斜面种子接入种子培养基中，经培养后得到种子液；

步骤（3）、将步骤（2）所得的种子液接入到含有甘草酸或甘草酸盐的产酶培养基中发酵培养，其中产酶培养基中含有外源促进剂，促进Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，其中外源促进剂为甘草总提取物、甘草总黄酮和/或甘草总多糖；

步骤（4）、从步骤（3）中获得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂，包括以下一种或几种：(a)含有已经产酶菌体的发酵液组分、（b）已经产酶的菌体发酵液离心后获得的全细胞菌体、（c）已经产酶的菌体破碎细胞后制得的粗酶液、（d）已经产酶的菌体冷冻干燥后制得的冻干粉、（e）含有固体培养和/或半固体培养所产生的β-葡萄糖醛酸苷酶的组分。

2.如权利要求1中所述的一种生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：步骤1中的转化反应体系中转化底物甘草总提取物和/或甘草总三萜粗品浓度为0.01～100g/L，缓冲液pH2～10。

3.如权利要求1中所述的一种生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：步骤2中转化为在摇瓶或发酵罐中发酵培养，摇瓶培养过程中控制摇床转速为100～400r/min，温度15～65℃，pH为2.0～10.0，培养时间12～120小时，发酵罐发酵过程中控制转速为100～400r/min，发酵温度15～65℃，pH为2.0～10.0，发酵时间24～240小时。

4.如权利要求1中所述的一种生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于：步骤2中的步骤（3）产酶培养基诱导剂为甘草酸或甘草酸盐，外源促进剂为从甘草中提出的甘草总提取物、甘草总黄酮和/或甘草总多糖，产酶培养基浓度（g/L）为：甘草酸或其盐0.1～20，外源促进剂0.1～20，其它培养基为NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，FeSO₄·7H₂O0.0001～1，控制pH2.0～10.0，温度115～125℃，15～30min灭菌后，冷却至室温。

5.步骤3中转化结束后得到含GAMG的发酵液，采用酸沉、溶剂萃取，大孔吸附树脂、硅胶、聚酰胺、C₁₈、葡聚糖凝胶方法中的一种或几种方法联合使用分离纯化得到GAMG。

6.一种以甘草总提取物或甘草总三萜为底物生物转化生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，具体步骤如下：

步骤1、将保藏号为CGMCCNo.5446的菌株Penicillium purpurogenum Li-3接入到斜面培养基上，经培养后得斜面种子；

斜面培养基浓度（g/L）为：葡萄糖0.01～10，NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，FeSO₄·7H₂O0.0001～1，琼脂0.01～30，控制pH2.0～10.0、温度115～125℃，15～30min灭菌后，冷却至室温；

步骤2、将步骤1所得的斜面种子接入种子培养基中，经培养后得到种子液；

种子培养基浓度（g/L）为：葡萄糖0.01～10，NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，FeSO₄·7H₂O0.0001～1，控制pH2.0～10.0，温度115～125℃，15～30min灭菌后，冷却至室温；

种子液为在摇瓶或发酵罐中培养，摇床转速100～400r/min，温度15～50℃，培养时间12～120小时，发酵罐发酵过程中控制转速为100～400r/min，通气比为0.1～10vvm，发酵温度15～65℃，溶氧为10～100％，pH为2.0～10.0，发酵时间12～120小时，再将活化的种子培养液按照1～20%（v/v）的接种量，接入种子培养基中进行二次活化，培养时间24小时，得二次活化种子液；

步骤3、将步骤2二次活化种子液按照1～30%（v/v）的接种量接入到含有甘草酸或甘草酸盐的产酶培养基中培养，其中产酶培养基中加入外源促进剂，至微生物被诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，其中诱导剂为甘草酸或甘草酸盐，促进剂为甘草总提物、甘草总多糖和/或甘草总黄酮；

产酶培养基浓度（g/L）为：甘草酸或其盐0.1～20，外源促进剂0.1～20，其它培养基为NH₄NO₃0.01～10，KH₂PO₄0.01～5，KCl0.01～3，MgSO₄·7H₂O0.01～3，FeSO₄·7H₂O0.0001～1，控制pH2.0～10.0，温度115～125℃，15～30min灭菌后，冷却至室温；

步骤4、将步骤3中产生β-葡萄糖醛酸苷酶的菌体的发酵液制备成β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂,β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂包括以下一种或几种：(a)含有已经产酶菌体的发酵液的组分、（b）已经产酶的菌体发酵液离心后获得的全细胞菌体、（c）已经产酶的菌体破碎细胞后制得的粗酶液、（d）已经产酶的菌体冷冻干燥后制得的冻干粉、（e）含有固体培养和/或半固体培养所产生的β-葡萄糖醛酸苷酶的组分；

步骤5、以甘草总提取物或甘草总三萜作为转化底物，向转化底物反应体系中加入步骤4中制备的β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂，转化甘草总提取物或甘草总三萜中的甘草酸及其类似物生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸，至GAMG浓度基本恒定，转化反应体系中转化底物甘草总提取物和/或甘草总三萜粗品浓度为0.01～100g/L,转化反应体系pH2～10；将转化反应体系放在摇瓶或发酵罐中转化培养，摇瓶培养过程中控制摇床转速为100～400r/min，温度15～65℃，pH为2.0～10.0，培养时间12～120小时，发酵罐发酵过程中控制转速为100～400r/min，发酵温度15～65℃，pH为2.0～10.0，发酵时间24～240小时；

步骤6、转化结束后得到含GAMG的发酵液，采用酸沉、溶剂萃取、大孔吸附树脂色谱、硅胶色谱、聚酰胺色谱、C₁₈制备液相色谱、葡聚糖凝胶和/或离子交换色谱方法中的一种或几种方法联合使用分离纯化得到GAMG；

其中甘草总提取物为市购产品或自制产品，其中自制产品的制备方法为：将含有甘草酸、甘草黄酮和甘草多糖的甘草属植物，包括根、根茎、茎、花和/或果实，采用温浸、渗漉、煎煮、回流、连续回流、超声、微波或超临界流体提取法中的一种或几种提取；所用溶剂为以下溶剂中的任一种：A.水、B.甲醇与水的混合物、C.乙醇与水的混合物、D.丙酮与水的混合物、E.碱性水混合物、F.碱性甲醇混合物、G.碱性乙醇混合物；料液比w/v（g/ml）为1:5～1:15；提取次数1～3次，提取时间每次0.5～1.5小时，将每次提取液合并；提取液减压浓缩后得到甘草总提取物浓缩液,或经过干燥后制得甘草总提取物粉末；

其中促进剂甘草总黄酮和甘草总多糖以及转化底物甘草总三萜为市购产品或自制产品，其中自制产品的制备方法为：将甘草总提取物浓缩液，或经干燥后制得甘草总提取物粉末加水溶解，加有机试剂，优选正丁醇、乙酸乙酯，再用酸碱调节体系pH6-7，摇匀萃取，体系静置分层，有机相为含甘草总黄酮类成分，分出有机相，干燥后得甘草总黄酮粗品，水相为含甘草总三萜和甘草总多糖类成分，分出水相，加有机试剂，调节体系pH2.5-3.5，摇匀萃取，体系静置分层，有机相为含甘草总三萜类成分，水相为含有甘草总多糖类成分，分出有机相，干燥后得甘草总三萜粗品，由于水相中含有的成分较杂，先将水相所含蛋白质除掉，优选的方法是用sevag法除蛋白质，再通过加95%乙醇或无水乙醇至乙醇浓度达到60～80%沉淀得甘草多糖，干燥后得甘草总多糖粗品。