[发明专利]一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法,属于食品添加剂（甜味剂）领域。 

背景技术

甘草是豆科甘草属灌木状多年生草本植物，是重要的食品添加剂和传统中药。甘草酸（GL）属于五环三萜类化合物，在甘草中含量最高（3-11%），是甘草中的主要活性成分之一，但是过多摄入甘草酸会导致人体内钠排出减少而钾排出增加，产生一定的副作用。GL水解掉一个葡萄糖醛酸基后生成产物——单葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG），结构见图1。GAMG甜度是甘草酸的5倍，是蔗糖的近1000倍，是一种高甜度、低热量的新型甜味剂。动物实验表明GAMG的LD50为5000mg/kg，远远大于甘草酸的LD50805mg/kg，说明GAMG比GL更安全。GAMG极性介于GL和甘草次酸（GA）之间为中等极性，在体内同时具有良好的溶解度和跨膜转运的能力，比GL和GA具有更好的生物利用度。作为食品添加剂GAMG比GL具有更多的优点。因此生产和开发GAMG具有很重要的应用价值和现实意义。 

由于甘草酸分子中的两个糖苷键的键能是相似的，化学水解法对这两个糖苷键的选择性很低，不能将甘草酸定向水解生成GAMG。利用生物转化生产GAMG，可以克服化学方法的低选择性、高耗能、高污染的缺点。生物转化是利用微生物、动植物的培养体系或其产生的酶制剂对外源化合物进行结构修饰的生物化学反应过程，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应，亦称酶促反应。该技术自20世纪50年代兴起，近10年迅速发展起来。酶催化的优点：高度的立体选择性、催化效率高和反应条件温和等，可以完成一些化学方法难以实现的反应。目前生物转化技术已广泛应用到食品、药品以及化工产品等领域中。 

目前已发现的能够转化甘草酸为GAMG的β-葡萄糖醛酸苷酶存在于肠道细菌、动物组织和土壤中，但是来源于肠道细菌和动物组织的酶普遍存在化学键选择性偏低的缺点，不仅产生GAMG，还产生大量的副产物甘草次酸（GA），见图1。来源于动物组织的酶成本高，制备较麻烦。发明人所在的李春教授课题组从新疆主要甘草产区中的土样中分离筛选出来的菌株——产紫青霉Penicillium purpurogenumLi-3，其诱导产生的β-葡萄糖醛酸苷酶能将商品甘草酸单铵盐水解生成GAMG，定向性好，甘草酸转化率可达88.45%(冯世江、李春等,高校化学工程学报,2007,21：977-982)。利用该菌定向生物合成GAMG的方法已申请了国家专利（CN101603067），菌种PenicilliumpurpurogenumLi-3已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏号：CGMCC No5446，保藏日期2011年11月04日。 

然而，甘草酸单铵盐是由甘草经多步分离纯化制得，原料价格限制了GAMG生产成本的降低。如果直接以甘草总提取物为碳源可以减少很多提取分离步骤，大大降低生产成本,而且,文献报道，甘草属植物中除甘草酸外，还有4种含GAMG骨架结构的化合物，只是糖连接的位置不同，见图2。若以甘草为原料通过适当的生物转化过程，可能使这4种化合物也转化生成GAMG，从而提高GAMG产量。但是,尽管甘草酸在甘草中含量最高,以甘草总提取物或甘草三萜粗品为碳源直接利用菌体进行生物转化生产GAMG却不能实现。 

本发明专利的方法不仅能够使以甘草总提物或甘草三萜粗品为碳源生物转化生成GAMG得以实现，而且在制备β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂过程中，以甘草酸单铵盐为碳源并添加促进剂，比以甘草酸单氨盐为碳源不添加促进剂产生的β-葡萄糖醛酸苷酶酶活提高，GAMG产率提高，时间提前（见实施例2）。产率提高一直是工业化生产追求的目标，时间提前可以节省很多能源，降低成本。该工艺研究可为未来工业化生产GAMG提供有力的技术支持。 

发明内容

本发明提供一种以甘草酸或甘草酸盐为碳源，添加一定量的促进剂（甘草总提取物、或甘草总多糖、或甘草总黄酮），促进菌株Penicillium purpurogenum Li-3诱导产生β-葡萄糖醛酸苷酶，获得β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂；以甘草总提取物或甘草总三萜为碳源，用该粗酶制剂生物转化甘草总提取物或甘草总三萜中的甘草酸及其类似物，生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法。本发明是通过以下技术方案实现的。 

第一项.β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的制备，包括以下步骤：