[发明专利]一种全封闭一体式核酸扩增与检测管

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是核酸扩增与检测领域。具体而言，本发明涉及一种全封闭一体式核酸扩增与检测管。此外，本发明还涉及一种扩增和检测核酸的方法，其包括使用本发明的全封闭一体式核酸扩增与检测管。此外，本发明还涉及包含所述全封闭一体式核酸扩增与检测管的试剂盒，以及所述全封闭一体式核酸扩增与检测管用于制备试剂盒的用途。

背景技术

聚合酶链式反应技术（以下简称PCR技术），是一种在体外快速扩增DNA的技术，其通常包括多个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤，并且在理想状态下，每经过一个循环，目的核酸分子的数目就扩增一倍。一般而言，经过30-40个循环后，目的核酸分子数目就能扩增到原来的近10⁹倍。因此，PCR是体外大量获得目的DNA片段的最有效方法，并且所获得的核酸分子可用于进一步的分析和检验。

目前，PCR技术已广泛地应用于基础研究和应用研究。例如，在基础研究中，PCR作为一个“无细胞基因扩增系统”，可用于克隆基因，并由此可对基因组DNA进行直接序列分析，检测突变位点，分析染色体重组等。在应用研究中，PCR则可以用于传染病的诊断、遗传疾病的检测、产前诊断、法医研究等。美国专利4,683,202；4,683,159；4,800,159；4,965,188等已对PCR技术做出了详细描述。

DNA的体内扩增是指，在细胞内有关因子的参与下，双螺旋的DNA分子被解链成2条单链，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物与单链DNA碱基互补配对，形成引物单链DNA复合物；在DNA聚合酶作用下，沿着5’-3’方向，按碱基互补配对原则，在引物3’端开始，逐一将互补的三磷酸脱氧核苷酸接上，最终形成一条新的双链DNA分子。

DNA分子的体外PCR扩增模拟了体内的三个步骤：首先，在大约95℃的高温下加热双链DNA分子，以使双链间的氢键断裂，从而使得DNA热分解成两条互补的单链DNA分子（这一过程称为高温解链反应）；然后，温度迅速降到大约50-65℃的范围内，在这个温度下单链DNA与引物按碱基互补配对原则结合（这一过程称为低温退火反应）；退火反应结束后，温度又迅速升高到72℃左右，在这个温度下，在DNA聚合酶以及适当镁离子浓度的条件下，从引物的3’端开始结合单核苷酸，从而形成一条新的DNA（这一过程称为延伸反应）。经过一个这样的过程，原来的一个DNA双链分子就形成了两个DNA分子，增加了一倍。反复进行高温解链-低温退火-中温延伸三个过程，就可以获得数量更多的复制双链，并且这些新形成的双链又可以作为下次循环的模板。

通过这样一种循环扩增方法，经过30-40个循环，目的核酸分子数目可由1个增加到原来的近10⁹倍。然而，PCR的高灵敏度始终伴随着这样的弊端，即，其极其容易被污染。仅仅1个DNA拷贝的污染就可能会导致获得错误的检测结果。因此，为了避免检测过程中的样品污染，国家卫生部明确规定：PCR临床诊断必须将样品处理、扩增和检测在分割的房间进行，而且物流是从样品处理，扩增至检测一个方向进行，否则扩增后的试管不能进行开放检测。

因此，如何在PCR的全过程中避免污染也是现今核酸扩增和检测领域的一个重要研究方向，并且也取得了很多的进展。例如，荧光PCR的出现使得对核酸产物的检测避免了开管取样的步骤，从而大大减少了核酸产物污染的机会。另外，UNG酶的使用也避免了PCR过程中核酸扩增产物的污染。然而，以上所述方法均需要昂贵的试剂或精密的仪器，且操作复杂，不适宜用于核酸的现场快速检测。

因此，本领域仍然迫切需要一种操作简单、快速、成本低廉、能够有效避免核酸扩增和检测过程中的污染的方法和装置。为此，本发明开发出了一种全封闭一体式核酸扩增与检测管。当使用本发明的全封闭一体式核酸扩增与检测管进行核酸扩增和检测时，在核酸扩增后无需开管即可进行核酸检测，从而有效避免了扩增产物的外泄以及扩增和检测中的污染。此外，使用本发明的全封闭一体式核酸扩增与检测管进行核酸扩增和检测时，操作简单、成本低廉、无须使用昂贵的试剂或精密的仪器，从而，本发明的全封闭一体式核酸扩增与检测管可广泛应用于核酸的体外诊断，且特别适宜用于核酸的现场快速检测。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。