[发明专利]一种提高变色栓菌（Trametes versicolor）漆酶产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种提高变色栓菌漆酶产量的方法。 

背景技术

氧化还原酶主导的酶催化氧化技术在工业上有着广泛的应用，目前已有应用的领域包括纸浆和造纸、纺织和食品工业等。其中，漆酶（苯二醇∶氧氧化还原酶，EC l.10.3.2）是最具有应用前景的氧化还原酶之一，主要用于有机合成、环境污染物的降解和染料脱色、生物检测和电化学分析、造纸工业中的纸浆漂白和废水处理、纤维原料的降解等。 

真菌漆酶是漆酶的主要来源，作为此类真菌的代表性菌株—变色栓菌（Trametes versicolor）被认为是用于生产漆酶的优良菌株之一，而且该真菌漆酶已经被一些国际知名公司（如Sigma）商品化，但是由于该产品的价格太高，尚不能满足规模化应用的要求。漆酶发酵表达水平低是造成漆酶生产和应用成本高的原因之一，因此，提高漆酶的产量，降低生产成本成为漆酶生产研究的主要目的。目前采用的策略包括漆酶高产菌株的筛选、漆酶的发酵工艺及其合成调控、漆酶基因的克隆和异源表达等。然而，常规的漆酶高产菌种的选育方法通常都是工作量大，效率低，获得高产菌株难度大；通过对漆酶发酵培养基的组成、pH、碳氮比、温度、通气量和诱导剂用量的优化，能够提高真菌漆酶的表达水平，但其提高幅度是非常有限的。虽然，漆酶已通过酵母、丝状真菌等成熟表达系统进行了表达，得到了一些高产量的工程菌株，但其产量与产漆酶真菌相比并无优势，仍需进一步提高才能满足工业上的需要。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高变色栓菌漆酶产量的方法。该方法能够大幅提高变色栓菌的漆酶产量；并且该方法操作简单，易于放大生产，适于大规模漆酶发酵，从而降低漆酶生产成本，满足规模化应用的要求。 

为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案： 

一种提高变色栓菌漆酶产量的方法，包括：在变色栓菌漆酶发酵过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加法尼醇，并继续发酵以产生漆酶。 

优选地，所述法尼醇添加的终浓度为10～100μM，例如10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM等，进一步优选为30～80μM，更进一步优选为40～60μM。 

优选地，以法尼醇溶液的形式向发酵液中添加法尼醇，所述法尼醇溶液的配制溶剂为乙醇、正丙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或至少两种的混合，进一步优选为乙醇或异丙醇。所述混合典型但非限定性的实例有：乙醇和正丙醇的混合，乙醇和异丙醇的混合，乙醇和正丁醇的混合，正丙醇和异丙醇的混合，正丙醇和正丁醇的混合，异丙醇和正丁醇的混合，乙醇、正丙醇和异丙醇的混合等。法尼醇易溶于有机溶剂，上述溶剂是配制法尼醇溶液的良好溶剂，并且对变色栓菌的菌丝体生长和漆酶合成无副作用。 

作为优选方案，所述方法具体包括如下步骤： 

（1）将预培养的变色栓菌菌丝体接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养； 

（2）在所述发酵培养过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加法尼醇溶液； 

（3）在菌丝体生长结束并进入漆酶合成阶段后，选择适于漆酶表达和分泌的pH、搅拌速率和通气量，并继续培养以产生漆酶； 

（4）培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。 

优选地，所述步骤（1）中所述变色栓菌菌丝体预培养方法、发酵培养基的组成采用已有文献报道的方法（Wang等人,Ultrasound-intensified laccase production from Trametes versicolor,Ultrasonics Sonochemistry,2013,20:118–124），培养温度26℃。 

优选地，所述步骤（1）中发酵培养的具体条件： 

pH为4.1～6.0，例如4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0，优选为4.5～5.5； 

搅拌速率为200～400rpm，例如200rpm、220rpm、240rpm、250rpm、260rpm、280rpm、300rpm、320rpm、340rpm、350rpm、360rpm、380rpm、400rpm，优选为250～350rpm；