[发明专利]一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，包括猪伪狂犬病毒gE抗原包被的酶联板、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体、快速包被液、快速封闭液、样品稀释液、TMB显色液、终止液、20倍浓缩洗液、阴性对照、阳性对照。

2.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述快速包被液是pH为10.0～14.0，浓度为0.1mol/L的NaOH；所述快速封闭液是pH为10.0～14.0，浓度为0.1mol/L的KOH。

3.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中含有质量分数为1%的酪蛋白，质量分数为0.001%的NaN₃。

4.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述TMB显色液中TMB的质量浓度为0.3g/L；所述终止液是浓度为2M的H₂SO₄溶液。

5.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述20倍浓缩洗液包括质量浓度为21g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、质量浓度为2.8g/L的NaH₂PO₄·2H₂O、质量浓度为170g/L的NaCl和体积浓度为20ml/L吐温-20。

6.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为经样品稀释液稀释的不含猪伪狂犬gE抗体的猪血清或血浆；所述阳性对照为经样品稀释液稀释的含有猪伪狂犬gE抗体的猪血清或血浆。

7.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒gE抗原包被的酶联板通过如下方法制备得到：

（1）以PRV Bartha-K61株的总DNA为模板，P1和P2作为引物进行PCR反应，其中：

引物P1的序列为：5′—GCGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGC—3′

引物P2的序列为：5′—CGCTCGAGTTAAGCGGGGCGGGACATCAAC—3′；

（2）回收的PCR反应产物，并将其克隆入pET28a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建成重组载体pET28a-E3，然后将重组载体pET28a-E3转化入大肠杆菌宿主菌BL21中，进行重组蛋白表达；

（3）纯化重组蛋白，得到猪伪狂犬病毒gE抗原；

（4）将猪伪狂犬病毒gE抗原包被固化于酶联板上。

8.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体溶液由以下方法制得：

（1）用猪IgG免疫家兔后，分离得到血清，将血清纯化后获得兔抗猪IgG抗体；

（2）用辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体；

（3）将20倍浓缩洗液进行20倍稀释后制备成原液，用原液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体，获得辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体溶液。

9.根据权利要求1～8中任何一项所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒在检测猪伪狂犬病中的应用。

10.一种用检测猪伪狂犬抗体的试剂盒测定猪伪狂犬抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）检测样品制备：采血后，3000转/分钟离心5分钟，取上清即得血清；

（2）平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用；

（3）配洗液：将20倍浓缩洗液用双蒸水稀释20倍备用；

（4）加样：在酶标板中分别设定空白对照、阳性对照、阴性对照，空白对照不加样品稀释液，阳性对照加入加入100μL阳性对照血清，阳性对照加入100μL阴性对照血清；在剩余的酶标板反应孔中中加入100μL检测样品，振荡混匀；

（5）温育：将酶标板置于室温避光反应20分钟；

（6）洗板：弃去反应液，反应孔中注满洗液，浸泡15秒，弃洗液。连续洗板5次，最后拍干；

（7）加酶：反应孔中加入100μL辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG溶液，其中空白对照孔不加；

（8）温育：将酶标板置于室温避光反应20分钟；

（9）洗板：洗板5次；

（10）显色：在包括空白对照孔在内的反应孔中，依次加入TMB显色剂100μL，振荡混匀，室温避光反应10分钟；

（11）终止：在包括空白对照孔在内的反应孔中，加入终止液各50μL，振荡混匀终止反应；

（12）测定：用酶标仪对空白孔调零，单波长450nm测定各孔OD值，并根据如下公式，并判定结果：

当测定标本OD值≥临界值的2倍，为抗猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性；

当测定标本OD值介于临界值与临界值的2倍之间时为可疑；

当测定标本OD值＜临界值，为抗猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阴性；

其中，临界值=0.10+阴性对照OD平均值，当阴性对照OD平均值≤0.05时，按0.05计算。