[发明专利]一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病检测领域，具体涉及一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒。

背景技术

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种急性传染病，多种家畜和野生动物都可以感染，以猪感染最为普遍，给养猪业造成很大的经济损失，接种疫苗是预防本病最为有效的方法。目前市面上的伪狂犬疫苗都是gE基因缺失疫苗，接种疫苗的猪只，血清中不含有猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体。如果在猪血清中检测出了gE蛋白抗体，说明猪已经被伪狂犬病病毒的野毒感染，可将感染的猪只淘汰，从而根除伪狂犬病。

目前一般采用间接gE-ELISA的方法来检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体，这些方法的特异性不是很强，敏感度不高，容易出现假阳性和假阴性，不可避免地会造成误判，并产生不必要的损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性强、灵敏度高，能快速、简便地检测猪伪狂犬抗体的试剂盒。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，包括猪伪狂犬病毒gE抗原包被的酶联板、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体、快速包被液、快速封闭液、样品稀释液、TMB显色液、终止液、20倍浓缩洗液、阴性对照、阳性对照。

所述快速包被液是pH为10.0～14.0，浓度为0.1mol/L的NaOH；所述快速封闭液是pH为10.0～14.0，浓度为0.1mol/L的KOH。

所述样品稀释液中含有质量分数为1%的酪蛋白，质量分数为0.001%的NaN₃。

所述TMB显色液中TMB的质量浓度为0.3g/L；所述终止液是浓度为2M的H₂SO₄溶液。

所述20倍浓缩洗液包括质量浓度为21g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、质量浓度为2.8g/L的NaH₂PO₄·2H₂O、质量浓度为170g/L的NaCl和体积浓度为20ml/L吐温-20。

所述阴性对照为经样品稀释液稀释的不含猪伪狂犬gE抗体的猪血清或血浆；所述阳性对照为经样品稀释液稀释的含有猪伪狂犬gE抗体的猪血清或血浆。

所述样品稀释液是通过在浓度为0.01M，pH为7.2的PBS中添加质量分数为1%的酪蛋白，质量分数为0.001%的NaN₃制备而成。

所述20倍浓缩洗液是通过在浓度为0.01mol/L，pH为7.4的PBST中添加质量分数为10%小牛血清制备而成。

作为优选的，所述的快速包被液的pH为13，所述的快速封闭液的pH为13。

所述的猪伪狂犬病毒gE抗原包被的酶联板通过如下方法制备得到：

（1）以PRV Bartha-K61株的总DNA为模板，P1和P2作为引物进行PCR反应，其中：

引物P1的序列为：5′—GCGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGC—3′

引物P2的序列为：5′—CGCTCGAGTTAAGCGGGGCGGGACATCAAC—3′；

（2）回收的PCR反应产物，并将其克隆入pET28a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建成重组载体pET28a-E3，然后将重组载体pET28a-E3转化入大肠杆菌宿主菌BL21中，进行重组蛋白表达；

（3）纯化重组蛋白，得到猪伪狂犬病毒gE抗原；

（4）将猪伪狂犬病毒gE抗原包被固化于酶联板上。

所述的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体溶液由以下方法制得：

（1）用猪IgG免疫家兔后，分离得到血清，将血清纯化后获得兔抗猪IgG抗体；

（2）用辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体；

（3）将20倍浓缩洗液进行20倍稀释后制备成原液，用原液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体，获得辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体溶液。

所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒在检测猪伪狂犬病中的应用。

一种用检测猪伪狂犬抗体的试剂盒测定猪伪狂犬抗体的方法，包括以下步骤：

（1）检测样品制备：采血后，3000转/分钟离心5分钟，取上清即得血清；

（2）平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用；