[发明专利]一种产生神经源性肌肉萎缩小鼠模型的受精卵的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种建立疾病的生物模型的方法，特别涉及一种产生神经源性肌肉萎缩小鼠模型建立的方法，属于生物技术领域。

背景技术

ALA(δ-氨基-r-酮戊酸)是血红素合成过程的第一步重要的中间产物，是血红素合成的第一个限速酶ALAS（δ-氨基-r-酮戊酸合成酶）催化的产物，ALA的过量堆积具有毒性损伤作用，目前，ALA的毒性作用机制还不清楚。ALA的堆积引起的毒性作用导致一些疾病的发生，申请者首次利用转基因技术建立ALASE过表达转基因小鼠模型。该模型经病理和行为学等的检测具有神经源性肌肉萎缩的表征。

该模型建立的前提是产生具有神经源性肌肉萎缩动物的受精卵，产生神经源性肌肉萎缩动物的受精卵的方法的建立是由于本课题组在研究过程中注意到ALAS（δ-氨基-r-酮戊酸合成酶）在某些因素的作用下导致ALA堆积，并且在自然状态下ALAS1(No tissue specific-type ALAS,ALASN)受到游离血红素的负反馈抑制，因此采用全身性过表达ALAS1的同工酶ALAS2(erythroid-specific ALAS,ALASE)的策略，避开血红素的负反馈抑制，造成ALASE转基因小鼠体内ALAS的活性显著升高。小鼠体内表现为ALA高而血红素(heme)不低的现象，有力支持了“ALA中毒学说”。因此，这一特征使得单独研究ALA的作用机制成为可能。

由于产生了神经源性肌肉萎缩动物的受精卵后，经过植入假孕鼠的输卵管的壶腹部，经鉴定产生ALAS-E转基因小鼠模型。该模型出现了明显的神经源性肌肉萎缩的临床表现，也使该模型成为研究ALA的堆积产生的毒性作用致肌肉萎缩的运动功能损伤机制的理想动物模型。

肌肉萎缩是以肌纤维横截面积减少和肌肉组织中蛋白含量降低，机体力量减弱，易疲劳以及胰岛素抵抗增加为表现。引起骨骼肌肌肉萎缩的原因很多，如去神经、饥饿、糖尿病、癌症、肾衰、老化等多种原因都能够引起骨骼肌萎缩。

发明所涉及的是与疾病相关的重要的生物学问题，神经源性肌肉萎缩病因尚未完全阐述清楚，迄今为止未见有ALASE诱发神经源性肌肉萎缩的报道。鉴于此，拟用ALASE过表达的转基因小鼠模型在动物的整体水平上研究ALA的毒性损伤作用与肌肉萎缩的关系，分析ALA堆积的毒性损伤机制，加深我们对血红素代谢异常产生的相关疾病的分子机制的认识，并为其防治由于血红素代谢异常产生的肌肉萎缩等运动系统疾病提供新的思路和方法。本研究是申请者在血红素代谢领域研究的新探索，是确定ALA堆积产生的毒性损伤在肌肉萎缩及运动功能障碍领域的前沿性研究。本发明不仅为神经源性肌肉萎缩的病因及发病机制作了理论上的补充，更为其治疗提供更多有价值的新理念。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种构建神经源性肌肉萎缩小鼠模型的方法。

本发明的目的是这样实现的：

1．构建一个线性转基因序列，该序列从5’端至3’端依次含有chickenβ-actin启动子，CMV增强子，ALAS-E(ALAS-2)的cDNA序列，终止信号rabbit β-globin poly(A)序列；

2．应用显微注射的方法将构建的基因序列注入到小鼠的成活的受精卵中；

3．在将步骤2选择显微注射后成活的受精卵植入假孕鼠的输卵管的壶腹部；

4．产生F0代转基因小鼠，该小鼠基因组中整合有外源性ALAS-E表达序列；

5．对步骤4获得的转基因小鼠进行鉴定；

6．将获得的阳性转基因小鼠与正常小鼠杂交，获得子代；

7．对转基因小鼠和正常小鼠的ALAS-E的mRNA水平、蛋白水平以及酶活性进行比较；

8．按照神经源性肌肉萎缩的病理、临床特征对ALAS-E过表达转基因小鼠进行鉴定。

本发明首先提出了编码ALAS-E的核苷酸序列在构建产生神经源性肌肉萎缩小鼠模型的受精卵中的应用。

其中，优选的，所述编码ALAS-E的核苷酸序列的GeneBank登录号为NM_009653.3。

进一步的，本发明还提出了含有编码ALAS-E的核苷酸序列的线性转基因序列在构建产生神经源性肌肉萎缩小鼠模型的受精卵中的应用，所述的线性转基因序列从5’端至3’端依次含有chickenβ-actin启动子，CMV增强子，ALAS-E cDNA序列以及终止信号rabbitβ-globin poly(A)序列。