[发明专利]一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法

权利要求书

1.一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）采用酚－氯仿法提取斑点叉尾鮰肌肉组织中的基因组DNA；

2）在斑点叉尾鮰线粒体DNA D-loop控制区设计PCR引物，其核苷酸序列为：

正向：5’-GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC-3’，

反向：5’-GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG-3’；

3）将步骤1）所得的基因组DNA在步骤2）设计的PCR引物的作用下进行PCR扩增，得到线粒体DNA D-loop序列；再将线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳的结果初步鉴定斑点叉尾鮰物种；

4）利用限制性内切酶EcoR Ⅰ对所述步骤3）所得的线粒体DNA D-loop序列在37℃的温度下酶切2～3小时；

5）将经过步骤4）酶切后的线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳的结果最终鉴定出斑点叉尾鮰物种。

2.根据权利要求1所述斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，其特征在于，所述步骤1）所得的基因组DNA分子量为9.5～10.5kb，浓度为400～1500ng/μl，A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.65～1.82之间。

3.根据权利要求1所述斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，其特征在于，所述步骤3）中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，54.8℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃。

4.根据权利要求1所述斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4）中限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切位点位于线粒体DNA D-loop序列的200bp处。

5.根据权利要求1所述斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，其特征在于，所述步骤5）中斑点叉尾鮰的线粒体DNAD-loop序列被限制性内切酶EcoR Ⅰ酶切成两个片段，大的分子量为850～950bp，小的分子量为150～250bp。