[发明专利]一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，尤其涉及一种利用线粒体DNA D-loop控制区进行斑点叉尾鮰物种遗传信息鉴定的方法，属于分子生物学PCR遗传鉴定领域。

背景技术

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus），亦称沟鲶（Channel Catfish），属鲶形目（Siluriformes）、鮰科（Ictaluridae）、叉尾鮰属（Ictalurus）。它原产于北美，其自然分布区在美国中部、加拿大南部和墨西哥北部。斑点叉尾鮰属名贵淡水经济鱼类，深受美国、加拿大及其它许多国家消费者的喜爱。加工好的成品或半成品在美国、日本、欧洲和加拿大等地市场均很畅销，市场需求量极大。自1984年，我国湖北省水产研究所首次引进斑点叉尾鮰，随着繁育、养殖以及加工技术的日趋成熟，再加上高额的投资回报效益，使得斑点叉尾鮰的养殖业和加工业在我国迅速蓬勃发展，出口创汇效益也逐年攀升。

据报道，近年来曾被美国政府视为“反倾销”而遭封杀的越南巴沙鱼贴着“中国斑点叉尾鮰”的标签进入美国市场，这不但严重损害我国斑点叉尾鮰的品牌，影响了我国斑点叉尾鮰产品的正常出口，而且扰乱了国际斑点叉尾鮰市场，因被美国多次退货给企业造成经济损失。作为主要依托科技手段保障经贸发展的出入境检验检疫部门也已经面临一项全新的任务和挑战。

对于已加工好的斑点叉尾鮰成品和半成品，由于形态已发生完全改变，主要依据骨骼结构和外部形态特征的传统物种鉴定方法在斑点叉尾鮰的物种鉴定上已完全不适用。此外，在成品和半成品中，由于细胞结构的破坏和蛋白质的严重变性，依据染色体特征的细胞分类学方法以及依据同功酶数据的酶学鉴定方法等也同样不适合斑点叉尾鮰的物种鉴定。

随着PCR技术和DNA测序技术的日趋成熟，通过DNA序列信息了解物种之间的遗传分化变得越来越普遍。线粒体DNA以其进化速率快，遵循母系遗传等特点，成为种群遗传学研究的有效标记之一。有关科技查新结果表明，国外已有线粒体DNA的PCR-RFLP的数据进行鳕鱼、比目鱼等制品中物种鉴定的报道，但均没有线粒体DNA的D-loop区的分子数据来进行斑点叉尾鮰物种鉴定方面的报道。而且PCR-RFLP方法操作过程繁琐，多用于对同一物种的不同群体进行遗传多态性分析，不适于快速、经济的鉴定斑点叉尾鮰物种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，解决现有技术的不足，利用已加工好的斑点叉尾鮰成品和半成品，快捷方便的鉴别出斑点叉尾鮰物种。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，包括以下步骤：

1）采用酚－氯仿法提取斑点叉尾鮰肌肉组织中的基因组DNA；

2）在斑点叉尾鮰线粒体DNA D-loop控制区设计PCR引物，其核苷酸序列为：

正向：5’-GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC-3’，

反向：5’-GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG-3’；

3）将步骤1）所得的基因组DNA在步骤2）设计的PCR引物的作用下进行PCR扩增，得到线粒体DNA D-loop序列；再将线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳的结果初步鉴定斑点叉尾鮰物种；

4）利用限制性内切酶EcoR I对所述步骤3）所得的线粒体DNA D-loop序列在37℃的温度下酶切2～3小时；

5）将经过步骤4）酶切后的线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳的结果，鉴定出斑点叉尾鮰物种。

本发明的有益效果是：线粒体DNA控制区具有个体和种群特异性，因此已被国际上广泛地用来作为物种鉴定的标准，尤其是D-loop控制区，不同物种差异较大，可以准确鉴定物种。本发明在对D-loop测序的基础上，寻找其酶切位点，并进行酶切鉴定，不需测序即可简单地鉴定出斑点叉尾鮰物种。本发明从分子水平鉴定斑点叉尾鮰物种，操作简单易行、快速实用，所耗时间短暂，极其适合对出入境的斑点叉尾鮰物种进行鉴定。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

基因组DNA的提取采用常规的酚-氯仿抽提法，具体参考萨姆布鲁克（2002）的方法稍作改动：

(1)取用酒精固定的尾鳍约0.1g于2ml离心管中，剪碎，置于37℃烘干；

(2)向离心管中加入500ul抽提缓冲液，并加入RNaseA，至终浓度为20μg/ml，37℃水浴1h。然后向抽提缓冲液中加入蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，55℃水浴过夜；