[发明专利]一种DNA片段的回收方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种DNA片段的回收方法，采用所述回收方法能从琼脂糖凝胶中同步回收琼脂糖和DNA片段。

背景技术

琼脂糖由D-半乳糖与3，6-内醚-半乳糖作为结构单元交替组成，是一种呈中性的直链多糖。其具有亲水性，并且几乎完全不含有带电基团，对敏感的生物大分子很少引起变性和吸附，在生物类应用上是理想的惰性载体。琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，一定浓度的琼脂糖水溶液在温度下降到35-40℃时能形成性能良好的半固体状的凝胶，由于利用琼脂糖进行凝胶电泳操作快速，简单，电泳作用低，因此广泛应用于分离和回收DNA片段，极大地促进了重组DNA技术的发展。目前已报道多种从凝胶中回收DNA片段的方法，CsCl密度梯度离心法，蔗糖密度梯度离心法在早期使用较多，但由于价格高、耗时等原因被其他方法代替；Dretzen发明DEAE—纤维素滤膜回收法，DNA得率高，但存在操作繁琐，DNA片段洗脱困难等问题；而低熔点琼脂糖法的试剂成本较高；利用冻融法和超声波破胶法回收的DNA纯度好，但回收率较低；虽然透析袋电洗脱法回收率高，也由于回收耗时过长而未能广泛使用；另外还有试剂盒法，玻璃奶法，琼脂糖酶法，挖孔法等，其各有利弊。

现有的DNA回收方法存在许多不足之处，如DNA回收效率低、耗费时间长、操作复杂、试剂成本过高，需要自制电泳洗脱装置，还有回收产物不纯等问题，给下游实验操作带来诸多不便，而这些问题至今仍没有被比较好地解决。另外，以上各种方法均不能兼顾琼脂糖的回收和利用，浪费昂贵的琼脂糖的同时不利于低碳环保。目前，对于在琼脂糖凝胶中同步回收琼脂糖和DNA片段的研究至今未见报道。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种DNA片段的回收方法，该方法可从琼脂糖凝胶中高效同步回收DNA和琼脂糖，具有廉价实用、低碳环保、快速简便、结果稳定可靠、设备要求简单等特点，旨在解决现有的DNA回收方法不能兼顾琼脂糖的回收和利用的问题，且还解决了现有技术中存在许多不足之处，如DNA回收效率低、耗费时间长、操作复杂、试剂成本过高、回收产物不纯等问题。

本发明的技术方案如下：

一种DNA片段的回收方法，其中，包括以下步骤：

A、在含有DNA的琼脂糖凝胶条中加入溶胶液，混匀，加热至琼脂糖凝胶条融化；

B、将融化后的溶液静置冷却，加入预冷的异丙醇，混匀，再次静置，琼脂糖析出形成沉淀；

C、分离得到琼脂糖沉淀和含有DNA片段的上清液；

D、分别回收DNA片段和琼脂糖；

步骤A中，所述溶胶夜为弱碱性的异硫氰酸胍溶液(PH值为8.0)。

所述的DNA片段的回收方法，其中，步骤C后，还包括以下步骤：

在琼脂糖沉淀中加入TE缓冲液洗涤琼脂糖沉淀，溶解残存在琼脂糖沉淀中的少量DNA片段，离心，取上清液与步骤C中的上清液合并。

所述的DNA片段的回收方法，其中，步骤A中，所述加热的过程为65-75℃水浴加热至琼脂糖凝胶完全融化；所述溶胶液为用TE缓冲液(PH值为8.0)溶解异硫氰酸胍制成，其浓度为0.25-0.40mol/L；所述溶胶液的用量为与所述含有DNA琼脂糖凝胶条等体积，或根据DNA片段的含量和琼脂糖凝胶条的浓度，适当调整所述溶胶液的用量；

步骤B中，所述静置冷却过程为置于冰上静置；所述预冷的异丙醇，其预冷温度为-20℃；所述再次静置过程为在冰上静置冷却。

所述的DNA片段的回收方法，其中，所述回收DNA片段过程包括以下步骤：

a1、在上清液中加入依次异丙醇和醋酸钠(PH值为5.2，浓度为3mol/L)溶液，置于低温-18℃至-30℃，沉淀DNA片段；

b1、用乙醇溶液洗涤DNA片段沉淀；

c1、晾干后加入TE缓冲液溶解得到回收的DNA。

所述的DNA片段的回收方法，其中，在进行回收DNA片段的步骤a1之前，若回收的DNA片段含有较多有机污染物或蛋白质，则需加步骤C所得的上清液用同样体积的酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清液。

所述的DNA片段的回收方法，其中，步骤c1中，若加入TE缓冲液后有沉淀出现，则将沉淀吹打均匀，使DNA片段充分溶解在TE缓冲液中，离心分离，吸取上清液，得到含有DNA片段的上清液。

所述的DNA片段的回收方法，其中，所述步骤c1中，异丙醇的用量为待加入溶液同等体积；所述醋酸钠溶液的用量为总体积的1/10体积。