[发明专利]显微镜的控温载物片及其使用光学显微镜观察抗冻蛋白冰晶形态变化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及冰晶形态观察技术领域，特别涉及抗冻蛋白溶液中冰晶形态变化的观察，以及利用普通光学显微镜观察冰晶形态变化的方法。 

背景技术

低温胁迫包括0℃-12℃之间的冷胁迫和O℃以下的冰冻胁迫两种，环境温度改变会引起物质在水溶液中发生物理化学变化。温度过低所导致的细胞结冰往往伴随着脱水，细胞内外渗透压增大，胞内浓度增大，细胞体积缩小，质膜系统和细胞骨架受到损伤，生物大分子活性改变、功能丧失，有害物质积累，植物细胞器如线粒体、叶绿体、核糖体的结构与功能受到影响。植物体内包括光合、呼吸、生长发育、代谢、蒸腾以及营养水分吸收等在内的几乎所有的生命活动都会不同程度地受到寒冷胁迫的干扰。因此，研究低温下植物存在的抗寒冷机制也成为当今热潮，其中丰富多样的低温诱导蛋白质中的抗冻蛋白（AFPs，又叫热滞蛋白质）在植物抗寒冷机制中有着十分重要的作用。 

从本世纪60年代DeVries等发现AFPs以来，人们试图分离纯化高活性AFPs，并期望将这一性状用于改良某些重要生物和农作物品种的抗冻性能，先后对鱼类、昆虫和植物AFPs开展研究。目前，AFPs成为农作物基因工程、组织器官低温保存和生物结构学研究的热点。 

研究发现，虽然不同抗冻蛋白在结构上有很大差异，但都具有相似的抗冻性能。迄今为止，发现的抗冻蛋白的抗冻功效主要有：以非依数性形式降低溶液冰点，修饰冰晶生成形态，抑制冰晶重结晶，降低过冷点，抑制冰核蛋白的成冰核作用，降低冰晶形成速度，保护细胞膜免遭低温损伤，以及降低玻璃化和去玻璃化损害。 

目前，观察研究抗冻蛋白的方法主要有一下几种； 

（1）经典的抗冻蛋白活性测定方法(DeVries法)，自DeVries提出利用相差显微镜 或倒置相差显微镜来观测毛细管中样品的结晶状态，毛细管法一直作为测定抗冻蛋白活性最基本的方法。此法是将待测样品装于毛细管内，快速冷冻。然后再缓慢升温使得毛细管内的冰晶熔融，冰晶开始消失的温度即为熔点。再缓慢降温使冰晶长大，冰晶开始生长的温度即为冰点。冰点和熔点之差即为热滞活性。没有抗冻蛋白的溶液中随着一开始降温就能清楚地观察到二次结冰。而在含有抗冻蛋白的溶液中，二次结冰在抗冻蛋白的作用被更低的温度克服时才出现。 

（2）改进的显微镜冰晶观察法。同样也是利用相差显微镜进行观察，不同的是，此种方法用特制的不锈钢样品槽代替了毛细管，低温循环仪通过乳胶管与圆柱盒侧壁相连，冷却剂酒精通过圆柱盒外腔时可以使悬浮的样品迅速降温，从而进行冰晶生长观察。与经典的DeVries法相比，改进法缩短了操作时间，不用进行毛细管的烧结与封蜡，温度控制更加直接和快捷，可以直接在显微镜下观察冰晶形态变化，这是DeVries法所不能的。但是改进法也有其不足,对仪器设备要求较高,除了需要使用相差显微镜外,还要特制不锈钢样品槽。 

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种显微镜的控温载玻片。 

又一目的提供一种使用普通光学显微镜观察抗冻蛋白冰晶形态变化的方法。在没有相差显微镜的条件下，可以用普通显微镜来进行冰晶形态观察，方法更加简便，推广性更强。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种显微镜的控温载玻片，其主要特点是将两片载玻片之间设有冷却软管，冷却软管的两端分别与低温冷却循环仪的出口和进口相连接。 

一种显微镜的控温载玻片，其主要特点是将两片载玻片之间设有冷却软管，冷却软管出口与蠕动泵的进口端连接，蠕动泵的出口端连接保温盒的进口端，保温盒的出口端与冷却软管进口相连接；在载玻片上设有快速检测探针温度计；在保温盒中有-20℃～-18℃的无水乙醇，保温盒的进口管和出口管分别插入-20℃～-18℃的无水乙醇内。 

一种使用普通光学显微镜观察抗冻蛋白冰晶形态变化的方法，其主要特点是包括有以下步骤： 

（1）.抗冻蛋白的提取；按常规提取。 

（2）.制备所述的显微镜的控温载玻片; 

（3）.吸取10μL浓度为10mg/ml的抗冻蛋白溶液滴于所述的控温载玻片上，调节显微镜，同时控制低温冷却循环仪使载玻片上的样品迅速冷却，速率为0.5℃／min,冷却到-15℃以下，逐渐结冰，待样品充分固化后，以0.05℃/5min的速率熔融冰晶，当冰晶融化体积达到1/3-1/2，温度为-2.15～-2.05℃时降温处理，速率为0.05℃/5min，温度降至-15℃，并观察冰晶生长过程。