[发明专利]牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法有效
申请号: | 201310313774.5 | 申请日: | 2013-07-24 |
公开(公告)号: | CN103388015A | 公开(公告)日: | 2013-11-13 |
发明(设计)人: | 谢小冬;高维东;纪银莉;宋礼;文鹏程;孙文静;冯丹;刘恭;何潇;葛静微 | 申请(专利权)人: | 甘肃华羚生物技术研究中心;兰州大学;甘肃华羚酪蛋白股份有限公司 |
主分类号: | C12P21/06 | 分类号: | C12P21/06;C07K1/16;C07K7/06;C07K7/08 |
代理公司: | 兰州振华专利代理有限责任公司 62102 | 代理人: | 张真 |
地址: | 730000 甘肃*** | 国省代码: | 甘肃;62 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 牦牛 乳酪 蛋白 抗凝 制备 方法 | ||
技术领域
本发明利用胰蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备及分离纯化抗凝血肽,属于生物技术领域。
背景技术
凝血是人体不可或缺的生理功能,但疾病凝血可诱发血栓,引发肺梗塞、脑血栓、视网膜动静脉阻塞、心肌梗塞和四肢及周围血管栓塞。目前,心脑血管病是我国发病率、致残率和死亡率最高的疾病,调查显示近年来每1000人中就有1-3人患有血栓类,每12s就有一人因中风或心梗而倒下。
心脑血管疾病已成为我国发病率致死率最高的疾病,其中大部分疾病与血栓相关。而临床上使用的肝素、香豆素、链激酶、尿激酶等物质易引发出血等副作用。从水蛭、蜱虫、钩口线虫、蛇毒和蜂毒中提取的抗凝溶栓活性物质具有良好的抗凝血效果,但毒副作用大。牦牛乳酪蛋白源生物活性肽因安全性高、易吸收,可以应用于抗血栓类产品的开发,用于血栓患者的辅助治疗。
牦牛乳酪蛋白是以西北特有的资源“曲拉”为原料,通过提取纯化制备的蛋白质,由于酪蛋白疏水性氨基酸含量高,不易溶于水,溶于弱碱液,限制了其在食品中的广泛应用。酪蛋白通过水解后,可以释放出各种生理功能肽,这些肽主要含2-20个氨基酸残基,分子量小于6000Da,易溶于水,能大大提高酪蛋白的原有营养价值。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足,提供一种牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法。用胰蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备抗凝血肽,采用葡聚糖凝胶柱对其进行分离纯化,得到纯度较高的酪蛋白抗凝血肽,从而实现了牦牛乳酪蛋白的深加工,同时也为心脑血管等疾病的预防与治疗提供一种安全、无毒副作用的新选择。牦牛乳酪蛋白抗凝血肽工艺简单,抗凝血活性明显,适合工业化推广生产。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法,其主要特点是包括以下步骤:
(1)牦牛乳酪蛋白;食品级。
(2)溶解:称取牦牛乳酪蛋白10-50g,加水500mL,调节反应温度30~50℃,pH5.5~7.5,搅拌,使牦牛乳酪蛋白溶解;
(3)酶解:称取0.25g~2.5g胰蛋白酶加入,维持反应温度30~50℃,pH5.5~7.5,反应1~4小时;
(4)灭酶,升温至80~100℃,维持5~15分钟;
(5)沉淀酪蛋白:用5mol/L盐酸调节pH到4.6,使酪蛋白在其等电点处析出;
(6)离心:4000~10000g离心力,离心除去酪蛋白沉淀,留上清液;
(7)喷雾干燥:取离心上清液,采用喷雾干燥机,对产品进行喷干,得到牦牛乳酪蛋白抗凝血肽。
所述的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法,还包括以下步骤:
(8)分离纯化:配制浓度为1%~5%的步骤(6)得到的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽进行上样,利用Sephadex G-15分离纯化,洗脱液为磷酸缓冲液pH6.8、0.02mol/L,收集在280nm处具有吸收峰的组分;
(9)活性检测:采用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测各组分活性;
(10)分子量及氨基酸序列测定:利用N端序列测定方法,确定四组抗凝血肽氨基酸序列结构,分别是来自a-S1酪蛋白91-100,8-22,4-22和β-酪蛋白177-183。
所选用的分离纯化方式为葡聚糖凝胶柱分离。
所述的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法,所述的确定四组抗凝血肽氨基酸序列分别是所述的a-S1酪蛋白91-100为YLGYLEQLLR;所述的a-S1酪蛋白8-22为HQGLPQEVLNENLLR;所述的a-S1酪蛋白4-22为HPIKHQGLPQEVLNENLL;所述的β-酪蛋白177-183为AVPYPQR。
本发明的有益效果:
1.本发明采用牦牛乳酪蛋白为原料,原料蛋白含量高,价格低,间接降低了生产成本;同时酶水解牦牛乳酪蛋白,产物溶解性好,易吸收,在提高了牦牛乳酪蛋白的营养价值的同时,使其具有预防血栓形成的功能。
2.食源牦牛乳酪蛋白抗凝血性肽,与其他来源的抗凝血性产品相比,安全性高,毒性较小,不存在出血等副作用。
3.利用葡聚糖凝胶分离纯化牦牛乳酪蛋白抗凝血肽,实现了抗凝血肽组分的分离,确定了抗凝血肽的分子量及氨基酸序列结构。
4.制备工艺简单,环保安全,易于实现工业化生产。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例1:一种牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法,包括以下步骤:
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