[发明专利]一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法

权利要求书

1.一种产碱性蛋白酶的菌株，具体为嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）Ap180，保藏号为CGMCC NO.7545。

2.如权利要求1所述的一种产碱性蛋白酶的菌株，其特征在于，所述菌株经液体深层通气发酵发酵液酶活力在80000u/ml以上。

3.一种以权利要求1所述的产碱性蛋白酶的菌株为菌种的工业化液体发酵方法，包括如下步骤：

（1）一级种子培养：将嗜碱芽孢杆菌Ap180斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；

（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；

（4）一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度32-36℃，搅拌速度200-400rpm，通风量V/V 1:1-2,罐压0.05MPa,培养时间10-20小时；

（5）发酵培养：将一级种子罐菌种以5-10%接种量接入发酵罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量V/V 1:1-3,罐压0.05MPa,培养时间70-100h；

溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30%；

pH值控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值值保持在7.0-7.5；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/ml-5mg/ml；

（6）提取：发酵结束后，将发酵液进行絮凝、压滤、超滤膜浓缩后即得到不同规格的碱性蛋白酶成品。

4.如权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，所述一级、二级、三级种子培养基组成为：

酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。

5.如权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，所述种子罐培养基组成为：

酵母粉0.4-0.8%，麦芽糊精5-15%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。

6.如权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，所述发酵罐培养基组成为：

酵母粉0.7-1.4%，玉米粉10-15%，豆饼粉1.5-3.0%，玉米浆0.5-1%，氯化钙0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，柠檬酸钠0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。

7.如权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，所述补料培养基组成为：麦芽糊精30-50%，豆饼水解液2.0-5.0%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。

8.如权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，所述发酵罐培养基的调配方法为：

按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH值为6.0，加入中温淀粉酶3u/g玉米粉与高温淀粉酶30u/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH值为7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min备用。

9.如权利要求7所述的液体发酵方法，其特征在于，所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:5-7均匀混合，然后加入豆饼质量5-7%的石灰，搅拌均匀，于120℃反应60-70min，降至室温，既得豆饼水解液。

10.如权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）一级种子培养：将嗜碱芽孢杆菌Ap180斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34℃，培养时间15h；

（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34℃，培养时间15h；

（4）一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度34℃，搅拌速度400rpm，通风量V/V 1:2,罐压0.05MPa,培养时间16小时；

（5）发酵培养：将一级种子罐菌种以10%接种量接入发酵罐，培养温度34℃，搅拌速度700r/m，通风量V/V 1:3,罐压0.05MPa,培养时间96h；

溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧25%；

pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH保持在7.3；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至5mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；

以Folin试剂显色法测定放罐发酵液酶活力为84105u/ml；

（6）提取：发酵结束后，将发酵液进行絮凝、压滤、超滤膜浓缩后加入稳定剂除菌即得到不同规格的碱性蛋白酶成品；

所述一级、二级、三级种子培养基组成为：

酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氢二钾1.5%，不足部分纯净水补足，pH8.0，123℃灭菌40min；

所述种子罐培养基组成为：

酵母粉0.8%，麦芽糊精15%，蛋白胨0.5%，玉米浆0.5%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸镁0.1%，不足部分纯净水补足，pH8.0，123℃灭菌40min；

所述发酵罐培养基组成为：

酵母粉1.4%，玉米粉14%，豆饼粉1.8%，玉米浆1%，氯化钙0.2%，磷酸氢二钾1.3%，硫酸镁0.05%，柠檬酸钠0.1%，不足部分纯净水补足，pH8.0，123℃灭菌40min；

所述补料培养基组成为：麦芽糊精45%，豆饼水解液4.0%，不足部分纯净水补足，pH78.0，123℃灭菌40min；

所述发酵培养基的调配方法为：

按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH6.0，加入中温淀粉酶3u/g玉米粉与高温淀粉酶30u/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温30min，然后缓慢升温至90℃保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH8.0，123℃灭菌40min备用；

所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:7均匀混合，然后加入豆饼质量7%的石灰，搅拌均匀，于120℃反应70min，降至室温，既得豆饼水解液。