[发明专利]一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体是一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法。

背景技术

碱性蛋白酶（Alkaline Protease）是一种最适PH为9-11的蛋白酶类，分子量26000-34000道尔顿，一般在PH5-10时较稳定。由于其活性中心含丝氨酸（Ser），故属于丝氨酸蛋白酶。它不但能水解肽键，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽的功能。广泛应用于洗涤剂、医疗、丝绸、制革等行业。

近年来，随着人们生活水平的提高以及环境保护的需要，含磷洗涤剂已基本被淘汰，取而代之的是各种加酶洗涤剂的大量应用。因洗涤剂的水溶液一般呈碱性，PH大约为9-11，故碱性蛋白酶已成为目前市场上使用最多的洗涤添加剂。它能大幅度提高洗涤去污能力，特别对奶渍、汗渍、血渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果。随着洗涤剂行业迅速发展，洗涤剂的用量增长迅速，市场对碱性蛋白酶的需求亦大幅度增加。

但是，目前市场上可产业化生产的碱性蛋白酶酶活力普遍较低，使得单位酶活力所对应的生产成本相对较高，这远远不能满足当前洗涤剂等行业的需求。如何提高碱性蛋白酶的酶活力，降低生产成本已成为现在最需要解决的问题。因此，使用优良菌株、改进发酵工艺，提高碱性蛋白酶酶活力对酶制剂工业具有非常广阔的开发潜力和应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法。

本发明提供的产碱性蛋白酶的菌株具体为嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）突变株Ap180。该菌株已于2013年5月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101），保藏号为CGMCC NO.7545。

所述菌株由盐碱地的野生菌经反复的紫外诱变及亚硝基胍诱变筛选获得，特性是产碱性蛋白酶效率高，稳定性好。

所述菌株经液体深层通气发酵发酵液酶活力在80000u/ml以上。

所述菌株生产的碱性蛋白酶的最适作用温度为40-60℃，最适pH值为9-11。

本发明还提供一种以上述嗜碱芽孢杆菌菌株为生产菌株的液体深层通气发酵方法，包括如下步骤：

（1）一级种子培养：将嗜碱芽孢杆菌Ap180斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；

（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；

（4）一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度32-36℃，搅拌速度200-400rpm，通风量（V/V）1:1-2,罐压0.05MPa,培养时间10-20小时；

（5）发酵培养：将一级种子罐菌种以5-10%接种量接入发酵罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量（V/V）1:1-3,罐压0.05MPa,培养时间70-100h；

溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制发酵过程溶解氧15-30%；

pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH保持在7.0-7.5；

补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/ml-5mg/ml；

放罐标准：60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。

（6）提取：发酵结束后，将发酵液进行絮凝、压滤、超滤膜浓缩后即得到不同规格的碱性蛋白酶成品。

所述一级、二级、三级种子培养基组成为：

酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。

所述种子罐培养基组成为：

酵母粉0.4-0.8%，麦芽糊精5-15%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-40min。