[发明专利]一种急性分离心肌细胞的方法及装置

说明书

技术领域

本发明属于心肌细胞分离技术领域，涉及一种急性分离心肌细胞的方法及装置。

背景技术

急性分离大鼠心肌细胞作为基础医学实验的一个常规方法，是进一步研究心肌细胞功能的关键步骤。虽然目前存在培养的心肌细胞，可供完成许多关于心肌细胞的实验，但是培养的心肌细胞存在许多缺陷，例如膜电位改变，离子通道特性改变，T-管密度降低，而急性分离心肌细胞在功能和结构上最接近生理状态，获得的实验数据也较可信，更具实际应用意义。某些情况下，例如观察不同处理因素对心肌细胞收缩和舒张功能的影响，只能采用急性分离的心肌细胞。

由于急性分离心肌细胞的优势，目前存在多种方法获取急性分离心肌细胞，主要包括两类：恒压分离法和恒流分离法。为了获取高质量的心肌细胞，除去必须的分离设备和实验试剂外，更多的是靠实验人员自身的经验，依据消化时间、心脏表面变化、灌注压力或流量变化、心脏软硬程度来判断消化终点。在长期分离细胞的过程中发现，幼年大鼠分离效果要好于成年大鼠分离效果，消化时间短的分离效果要好于消化时间长的分离效果，夏天的分离效果要好于冬天的分离效果，心肌细胞分离效果的不稳定很大程度影响了后续实验的顺利开展，其中问题长期得不到解决。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种急性分离心肌细胞的方法及装置，排除心脏体积、消化时间对分离效果的影响，增加分离效果的稳定性，获得稳定一致的高质量心肌细胞。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种急性分离心肌细胞的方法，包括以下操作：

1）将离体的心脏行主动脉逆行插管后，将心脏悬挂于Langendorff灌流装置中，用消化液37℃恒温恒流灌流心脏；

所述的消化液为：心脏灌流液30ml、胶原酶I30mg充分混合；

所述的心脏灌流液：MEM5.55g、HEPES sodium salt2.00g、BSA0.5g、去离子水500ml充分混合，pH为7.40；

2）采用pH计监测分离过程中消化液pH的变化，依据监测结果，每隔一定的时间加入碱液调节消化液pH为7.40，消化全程维持pH的稳定；

3）当消化完成后，取出心脏经剪碎吹打，获得急性分离的心肌细胞。

所述的消化液用质量浓度1%的氢氧化钠溶液来调节其pH。

所述的消化液灌注的流速在8～10ml/min之间。

所述每隔2.5min加入质量浓度1%的氢氧化钠溶液调节消化液pH，使其稳定的维持在7.40。

所述的消化液灌注时间不超过50min。

所述的消化液在室温配制液体时，将pH值调至7.50；当其在37℃恒温灌注时，消化液的pH值随着温度升高会逐渐下降至7.40。

当心脏表面颜色变为红白相间，血管轮廓模糊，心脏整体由硬变软，冠脉压力由低升高后再降至消化初始压力时，认为是终止消化的指标，消化完成。

一种急性分离心肌细胞的装置，包括：

langendorff装置：维持消化液沿管路循环灌注心脏冠脉系统；

蠕动泵：设置在消化液循环回路上，维持消化液灌注的流速在8～10ml/min之间；

恒温装置：维持消化期间消化液温度于37℃；

压力传感器：监测心脏冠脉内压力，并将检测结果发送给控制单元；

pH计：监测消化液pH值，并将检测结果发送给控制单元；

控制单元：显示所接收的心脏冠脉内压力和消化液pH值，并每隔一段时间控制微量泵向消化液循环管路泵入碱液，维持调节消化液pH为7.40；

微量泵：接收控制单元发出的指令后，向消化液循环管路泵入碱液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：本发明提供的一种急性分离心肌细胞的方法及装置，

鉴于在心肌细胞分离时心脏消化期间，随着时间的延长，心脏代谢产物不断积累，消化液pH值不断下降，到达消化终点时（约30min）pH值已降至7.10～7.20，此范围已经远远偏离机体内环境pH值范围7.35～7.45。而正常生理pH值范围很窄，一旦超过此范围，对心肌细胞就会产生不利影响。本发明通过每隔2.5min加入一定量碱液调节消化液pH，使其稳定的维持在7.40附近，与机体内环境保持一致；能够显著提高心肌细胞分离效果，同时排除心脏体积、消化时间、季节温度对分离效果的影响，增加分离效果的稳定性，获得稳定一致的高质量心肌细胞。

在维持消化液的pH值的稳定后，本发明所分离的获得的杆状心肌细胞存活比率高，质量好，存活比率明显增加，可以达到87±7%。