[发明专利]液相-串联质谱同时检测9种端基炔类激素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种烃类激素的检测方法，具体涉及一种利用液相-串联质谱检测烃类激素的方法。

背景技术

在已有的方法检测当中，也有用液相-串联质谱法对炔雌醇、炔诺酮等部分物质进行检测，但尚未见有同时测定这9种物质的方法。由于点击反应方法(点击化学(click chemistry)，还可以称为链接化学，是由Scripps研究所的诺贝尔化学家获得者Sharples^[1]首次提出的快速、可靠而又选择性高的化学合成新方法。该方法以可靠、高效、高选择性地通过C-X-C杂原子连接合成一系列的化合物。)的适用性，本发明用于解决复杂生物基质中的低含量端基炔类激素的检测，本发明主要选取炔雌醇(Ethinylestradiol)、炔诺酮(Norethisterone)、左炔诺孕酮(Levonorgestrel)、醋酸炔诺酮(Norethisterone acetate)、达那唑(Danazol)、双醋炔诺醇(Etnynodiol Diacetate)、尼尔雌醇(Nilestriol)、炔雌醚(Quinestrol)、庚酸炔诺酮(Norethisterone Enanthate)这9种弱极性端基炔类激素在复杂生物基质中的定量检测。建立了样品中炔雌醇等9种物质进行同时测定的液相色谱-质谱法，考察了这9种物质在血清和尿液中的分离影响，并进行了定量方法的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能同时检测上述九中激素的方法，本发明方法解决了低含量端基炔类激素的检测问题，特别是复杂生物基质中低含量端基烃类激素的检测问题，并且快速、准确、高效。

本发明提供一种新型的衍生样品前处理方法，克服了炔类物质在电喷雾离子源中电离效率低的缺点，适用于复杂生物基质样品的批量检测。该方法所用试剂少，且催化试剂便宜，易实现。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种液相-串联质谱同时检测多种端基炔类激素的方法，通过点击反应使其在电喷雾电离下能带上电荷，从而能检测到衍生好的待测物；其中所述点击反应包括以下具体步骤：

1、生物基质血清中点击反应前处理步骤

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：纯水或血清，混标，DMSO、内标炔诺酮-d6、H₂O、(s)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐、CuSO₄溶液、NaAsc溶液。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入EtOAc，涡旋1min，然后离心，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用CH₃OH复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

2、生物基质尿液中点击反应前处理步骤

于2mL pp管中按顺序加入下列反应物：纯水或尿液，混标，DMSO、内标炔诺酮-d6、H₂O、(s)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐、CuSO₄溶液、NaAsc溶液。涡旋1min后，放入37℃恒温振荡仪中反应4h。取出后加入EtOAc，涡旋1min，然后离心，取上层清液，置于氮吹仪中吹干。用CH₃OH复溶，进样。其中每个反应平行做两个样。

较佳的，步骤1中每200μL纯水或血清加入混标50μL、MMSO150μL、50ng/mL的内标炔诺酮-d610μL、H₂O50μL、500μg/mL(s)-2-叠氮-3-甲基丁酸·环己铵盐20μL、20mM CuSO₄溶液10μL和5mM NaAsc溶液10μL，反应后加入的所述EtOAc为1ml，用100μL CH₃OH复溶。

较佳的，所述混标为变量。

较佳的，步骤1中，所述离心的具体条件是：10000g，5min。

较佳的，步骤2中，CuSO₄溶液为25mM，10μL；NaAsc溶液为40mM，10μL；其余同步骤1。

进一步的，本发明采用以下技术方案：

一种液相-串联质谱同时检测多种端基炔类激素的方法，包括以下具体步骤：

1、标准溶液的配制

分别准确称取表1中各底物标准品于容量瓶中，用CH₃OH超声溶解，定容，制得500μg/mL各单标储备液；各储备液置于4℃冰箱内保存，使用时用CH₃OH稀释。