[发明专利]一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体及其构建方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸ε-酰基或其他酰基反应，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键。特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生物医药等领域。但由于MTG异源表达分泌量低等缺陷，限制了MTG的应用范围。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供获得上述谷氨酰胺转胺酶突变体的方法，包括如下步骤：

1）通过PCR或化学全合成的方法获得Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062，得到谷氨酰胺转胺酶基因序列及其上下游序列，序列如Genbank：EU477523所示；2）通过缺失突变获得Del1-4谷氨酰胺转胺酶突变体；3）以在步骤2）获得的突变体基础上，通过定点突变对E62进行突变，获得突变体Del1-4/E62D谷氨酰胺转胺酶突变体；4）在步骤3）获得的突变体基础上，融合tag1获得如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转胺酶突变体。

其中Del1-4/E62D构建方法如下；

在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株（Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062），通过基因克隆或化学全合成方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子（Genbank：EU477523），将其克隆到表达质粒pBB1-1011作为本发明改造中的模板。

a）以上述模板为材料，通过SEQ ID NO.3为上游引物，SEQ ID NO.4为下游引物，PCR获得TG突变体的基因序列，将获得的TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，转化到E.coli JM109挑选阳性转化子，将测序正确的突变质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得突变体Del1-4；

SEQ ID NO.3为GAGAGGGTGACCCCTCCTGCCGAG

SEQ ID NO.4为GGGGGCCCGGAAGAGCGCACTG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃1min40s24个循环72℃10min

b）Del1-4基因为模板，对E62进行突变，引物如下。

SEQ ID NO.5为GACAGGGTGACCCCTCCTGCCGAG

SEQ ID NO.6为GGGGGCCCGGAAGAGCGCACTG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃7min24个循环72℃10min

将获得的TG突变体基因连接到表达载体pET-22b(+)上，转化到E.coli JM109挑选阳性转化子，提取质粒测序。测序反应由上海生工生物工程公司完成。将测序正确的突变质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得突变体Del1-4/E62D。

由于C端氨基酸对TGase催化活性和热稳定性具有重要作用，因此选取在TGase酶C端添加稳定短肽，通过增加其与成熟酶N端或其他区域之间相互作用，提高蛋白稳定性。在蛋白C端添加适当的短肽可提高蛋白稳定性，将7个氨基酸作为稳定短肽插入到Del1-4/E62D谷氨酰胺转氨酶突变体C端，得到对应突变酶为Del1-4/E62D-tag1。

以突变质粒Del1-4/E62D为模板，进行全质粒PCR。引物如下。

SEQ ID NO.7为：ATCGGTTGCATCATCCTGACGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAG

SEQ ID NO.8为CGACCAGCCCTGCTTCACCTCG

PCR反应条件为：95℃5min95℃5min65℃30s72℃7min24个循环72℃10min