[发明专利]艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，所述特异性引物和探针由艰难梭菌毒素A（tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的特异性引物和探针组成，其特征在于所述特异性引物和探针序列如下：

tcdA上游引物:5′-TCAGGAGTTGTTAAATCGTGGAAA-3′；

tcdA下游引物:5′-CAGAGTGAATACCTGGAAGCATATCA-3′；

tcdA荧光探针:5′-FAM-CTGCAGCATCTGACATAG-BHQ1-3′；

tcdB上游引物:5′-GATAATATTTACGGACAAGCAGTTGACT-3′；

tcdB下游引物:5′-AGTCTCAATTGTATAGGTTTCTCCAAAA-3′；

tcdB荧光探针:5′-VIC-AGCGGTTTAGTTAGAGTTG-BHQ1-3′；

cdtA上游引物:5′-TGGGAAGCACTATATTAAAGCAGA-3′；

cdtA下游引物:5′-ACATCAGCAAGTTCATTAGGTGTT-3′；

cdtA荧光探针:

5′-ROX-TTTGCTTTACCCCAAGARTCCCCCT-BHQ2-3′；

cdtB上游引物:5′-ATTTCTTTGACCCAAAGTTGATG-3′；

cdtB下游引物:5′-CCCACTTAACTGCAATTAAGTCC-3′；

cdtB荧光探针:

5′-CY5-TGATTGGGAAGACGAAGATTTGGAT-BHQ2-3′；

其中FAM、VIC、ROX和CY5为不同波长的荧光报告基团，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括艰难梭菌毒素A（tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的标准品，所述标准品序列如下：

tcdA标准品：

tcaggagttgttaaatcgtggaaatttagctgcagcatctgacatagtaagattattagccctaaaaaattttgg

cggagtatatttagatgttgatatgcttccaggtattcactctg；

tcdB标准品：

gataatatttacggacaagcagttgactatagcggtttagttagagtggtgaagatatatattattttggagaaa

cctatacaattgagact；

cdtA标准品：

tgggaagcactatattaaagcagaagcatctgttgtaagtagtcttgattttaaagatgatgtaagtaaggggg

attcttggggtaaagcaaattataatgattggagtaataaattaacacctaatgaacttgctgatgt；

cdtB标准品：

atttctttgacccaaagttgatgtctgattgggaagacgaagatttggatacagataatgataatataccagatt

catatgaacgaaatggatatactattaaggacttaattgcagttaagtggg。

3.利用权利要求1所述试剂盒检测艰难梭菌毒素基因的方法，所述方法包括：

（1）提取待测样品DNA；

（2）以待测样品DNA为模板，加入艰难梭菌毒素A（tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的特异性引物和探针，PCR缓冲液，脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反应液，进行PCR扩增，以非靶细菌为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增；

（3）PCR扩增产物进行荧光检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线，若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。