[发明专利]艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

（二）背景技术

艰难梭菌（Clostridium difficile）为革兰阳性厌氧产芽孢杆菌，是人类肠道中的正常菌群之一，广泛分布于自然环境和动物粪便中。艰难梭菌自身没有侵袭性，但当大量服用广谱抗生素、免疫抑制剂、质子泵抑制剂或化疗药物后使其肠道一些其他正常菌群受到抑制，艰难梭菌在肠道内大量繁殖，其中部分产毒株可通过分泌毒素A、毒素B引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至伪膜性肠炎。部分高产毒力株产生二元毒素将导致疾病发生率和复发率增高，更需重视的是提高了疾病的严重性和致死性。据报道25%～30%抗生素相关性腹泻是由艰难梭菌引起的，而伪膜性肠炎则几乎100%由艰难梭菌所致。

在过去二十年中艰难梭菌出现了发病率、严重程度和复发率上升的趋势，所有这些都与预后不佳有关，并已成为欧美排名第1的“超级臭虫”。现在美国已将艰难梭菌感染与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素的肠球菌并列于美国三大医院获得性感染之列。根据国外经验，为控制艰难梭菌的广泛传播，最重要的是发展更为敏感和快速的检测方法，以及时发现，及早诊治。艰难梭菌的传统检测方法为粪便培养加细胞毒素测定，但其检测周期长，不能满足临床对快速检测的需要。谷氨酸脱氢酶（GDH）测定法为检测艰难梭菌表面大量表达的抗原性酶蛋白，其稳定性好、敏感性高，但特异性差，无法区分艰难梭菌产毒株与无毒株。酶免方法（EIA）具有快速可行性。但其敏感性为60%至70%，特异性为98%。鉴于其敏感性适中，当EIA检测阴性而临床症状明显时，常选用其他敏感性更高的方法进行验证检测。因此，实验室开发一种快速、特异、灵敏的艰难梭菌毒素基因检测方法意义重大。实时荧光定量PCR是近几年发展起来的新型检测技术，具有快速、准确、可定量等优势，其中TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、复合探针、染料及分子信标等方法目前已成功应用到病原菌分子诊断领域。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种艰难梭菌四种相关毒素基因的多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，所述特异性引物和探针由艰难梭菌毒素A（tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的特异性引物和探针组成，所述特异性引物和探针序列如下：

tcdA上游引物:5′-TCAGGAGTTGTTAAATCGTGGAAA-3′；

tcdA下游引物:5′-CAGAGTGAATACCTGGAAGCATATCA-3′；

tcdA荧光探针:5′-FAM-CTGCAGCATCTGACATAG-BHQ1-3′；

tcdB上游引物:5′-GATAATATTTACGGACAAGCAGTTGACT-3′；

tcdB下游引物:5′-AGTCTCAATTGTATAGGTTTCTCCAAAA-3′；

tcdB荧光探针:5′-VIC-AGCGGTTTAGTTAGAGTTG-BHQ1-3′；

cdtA上游引物:5′-TGGGAAGCACTATATTAAAGCAGA-3′；

cdtA下游引物:5′-ACATCAGCAAGTTCATTAGGTGTT-3′；

cdtA荧光探针:

5′-ROX-TTTGCTTTACCCCAAGARTCCCCCT-BHQ2-3′；

cdtB上游引物:5′-ATTTCTTTGACCCAAAGTTGATG-3′；

cdtB下游引物:5′-CCCACTTAACTGCAATTAAGTCC-3′；

cdtB荧光探针:

5′-CY5-TGATTGGGAAGACGAAGATTTGGAT-BHQ2-3′；

其中FAM、VIC、ROX和CY5为不同波长的荧光报告基团，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团。

本发明的关键在于扩增引物的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择。PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制，例如将Tris-HCl、KCl、MgCl₂等按比例混合进行配制，进行检测时，将PCR反应试剂和扩增引物和探针混合，再加入待测样品或对照品，即可进行PCR扩增反应。