[发明专利]牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明所涉及的牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，属于兽用生物制品领域。 

背景技术

牛病毒性腹泻/粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒（BovineViralDiarrheaVirus，BVDV）引起的传染病。BVDV在世界范围内广泛分布，给全球乳、肉牛带来巨大的经济损失，山羊（TOPLIFFCL,SMITHDR,CLOWSER SL,et al.Prevalence of bovine viral diarrhea virus infections in alpacas in the United States.J Am Vet Med Assoc,2009,234(4):519-529.）、绵羊、猪（TERPSTRA C,WENSVOORT G.Acongenital persistent infection of bovine virus diarrhoea virus in pigs:clinical,virological and immunological observations.Vet Q,1997,19(3):97-101.）、鹿及小袋鼠等动物都是BVDV的宿主和传染源（LINDBERG A,BROWNLIE J,GUNN GJ,et al.The control of bovine viral diarrhoea virus in Europe:today and in the future.Rev Sci Tech,2006,25(3):961-979.）。牛血清、冷冻胚胎、牛精液等牛源产品都可能污染BVDV，造成BVDV的传播。在兽用疫苗生产中，常使用牛血清、牛睾丸细胞、胰酶等牛源材料作为原材料。因此，一旦这些原料污染了BVDV，则必将导致疫苗产品的污染。尤其是猪用疫苗污染后，会导致免疫猪感染BVDV，造成自身类似猪瘟的临床症状给猪瘟的诊断带来困难外，还会成为BVDV的污染源。 

目前BVDV的检测主要有荧光抗体检测法、绿猴肾（vero）传代细胞检测法、致细胞病变和（或）红细胞吸附外源病毒的检验法（中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程.北京:化学工业出版社,2000,180-192.）等，这三种方法相对来说比较耗时、费力、灵敏度较低。近年来发展起来的RT-PCR，荧光定量RT-PCR逐渐成熟并应用于分子生物学各领域。而荧光定量RT-PCR与普通RT-PCR相比具有灵敏性更强、特异性更好，污染几率小，自动化高、高通量等优势。 

本发明的目的是结合荧光定量RT-PCR技术建立一套快速、特异、灵敏的检测BVDV的荧光定量RT-PCR试剂盒，用于疫苗生产中牛源原材料污染BVDV的检测以及猪和牛的BVDV感染的检测。 

发明内容

一、本发明的主要技术原理 

实时荧光定量聚合酶链式反应（Real--time Fluorogenetic Quantitative PCR,FQ-PCR）技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术（Heid,C.A.,etal.,Realtime quantitative PCR..Genome Res,1996.6(10):986-94.），该技术是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，它可以采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测。FQ-PCR技术包括探针类和染料类两种（Wittwer,C.T.,etal.,Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.Biotechniques,1997.22(1):130-1,134-8）。探针类是利用与模板特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以TaqMan^TM技术为代表，常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX；染料类是应用一种能与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，常用的是SYBRGreenI染料。