[发明专利]一种蜡蚧菌蛋白酶分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白酶的分离纯化工艺。更具体地，本发明涉及一种蜡蚧菌蛋白酶的分离纯化方法。 

背景技术

蜡蚧菌隶属丝孢菌类(Hyphomycetes)，广泛分布于热带、亚热带和温带，能寄生蚧类、蚜虫类、螨类和粉虱，还可寄生鳞翅目的一些害虫及线虫、蓟马等。20世纪70年代以来，欧洲一些国家及美国、日本等国对利用蜡蚧菌防治温室蔬菜害虫给予极大重视。蜡蚧菌对保护地粉虱各虫态均可感染，可以在粉虱种群中流行。在不适宜传播条件时，能在温室中生存一段时间。且蜡蚧菌的流行受粉虱种群密度的限制不大，不受人工培养基上转代培养次数等的影响，致病力稳定，不易变异。因此该菌被认为是防治粉虱的重要病原微生物，而得到大力研究与开发。

蛋白酶是一类可以催化蛋白质水解反应的酶，广泛存在于各种生物体中。它们参与细胞的正常生理以及异常的病理条件下的诸如蛋白质水解、细胞生长和迁移、酶原激活、激素释放等各种复杂的过程。蛋白质是昆虫体壁的重要组成部分，而穿透体壁是在昆虫病原真菌感染寄主的重要过程之一。蜡蚧菌胞外蛋白酶可分解蛋白质性质的昆虫表皮，这有助于菌丝的入侵，并为菌丝提供营养。对蛋白酶进行分离纯化和其蛋白酶酶学性质的初步研究，为揭示虫生真菌致病机理并指导其生产应用奠定基础，可为将来真菌防治害虫的深入研究提供科学依据。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种蜡蚧菌蛋白酶分离纯化的方法，为蛋白酶基因的克隆表达和揭示虫生真菌致病机理并指导其生产应用奠定基础；

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

（1）用优化试验筛选出的培养基培养菌株，在蛋白酶活性达最高时取发酵液；

（2）蜡蚧菌蛋白酶，在上述发酵液基础上，由下述纯化方法获得：

（2.1）粗酶液的制备：将发酵液在8500rpm离心10min，上清液用真空抽滤，收集滤液。向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为60%wt，4℃静置过夜。11000rpm、4℃离心15min收集沉淀，用适量的溶解沉淀。12000rpm、4℃离心15min除去不溶物体，上清液0.02mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）经透析，再用聚乙二醇浓缩后即为粗酶液。

（2.2）DEAE Sepharose fast flow阴离子交换柱层析：用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)充分平衡DEAE Sepharose fast flow阴离子交换柱层析柱，上样经过PEG20000浓缩的粗酶液，先用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)冲洗层析柱，后换用0-1mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行连续洗脱。洗脱条件设置为：流速30mL/h；5mL/管，收集具有酶活性部份。

（2.3）Sephadex G-150分子筛层析：通过0.02mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）充分平衡的Sephadex G-150分子筛层析柱（1.8×100），将2.1收集的具有酶活性部分上样于其，再用相同的缓冲液进行洗脱。洗脱条件设置为：流速15mL/h；5mL/管。收集酶活性部位。

（2.4）纯化蛋白酶的分子量检测：采用不连续垂直板电泳系统测定蛋白酶的纯化程度及分子量，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%，凝胶大小为100 mm×70×0.75mm。所用的标准蛋白为：磷酸化酶B94 000；牛血清蛋白67 000；肌动蛋白43 000；碳酸酐酶30 000；大豆蛋白酶抑制剂20100；乳清蛋白 14 400。电泳后用考马斯亮蓝法显示蛋白条带。

本发明采用的杀虫蜡蚧菌为蜡蚧轮枝菌L. lecanii FJ28（邱君志等，金属离子对蜡蚧菌几丁质酶活力的影响，激光生物学报，2009年2月）。

本工艺特异性高，工艺简单，蛋白质不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。

附图说明

图1蛋白酶液的DEAE Sepharose fast flow阴离子交换柱层析结果

图2蛋白酶液的Sephadex G-150分子筛层析结果

图3 蜡蚧菌蛋白酶纯化过程中各步活性成分SDS-PAGE图谱；其中泳道M为标准蛋白，泳道1为60%(NH₄)₂SO₄沉淀粗酶液，泳道2为经Sephadex G-150分子筛层析后的纯酶。

 

具体实施方法：