[发明专利]双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法及制剂

权利要求书

1.双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法，其特征在于，对蛇毒进行两次离子交换层析纯化，步骤如下： 

（1）第一次离子交换层析分离纯化：

a）眼镜蛇粗毒的溶解：

配制0.02M的磷酸盐缓冲液为A液，

配制含0.8M NaCl的A液为B液；

称取眼镜蛇粗毒，用A液溶解，离心取上清液为蛇毒液，备用；

b）SP-Sephodex-C25凝胶柱分离纯化：

将SP-Sephodex-C25凝胶用0.3N NaOH浸泡，用纯水洗至中性，抽干取出置烧杯中加A液抽气，取出装于XK-5030柱中，用A液平衡，将上述离心好的蛇毒液加入SP-Sephodex-C25凝胶柱中，流速为8-12ml/分，用A液进行洗脱，再用15-35%梯度进行梯度洗脱，然后用100% B液洗脱，最后用A液600ml平衡柱子，按标准分离纯化图谱收集一次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白，备用； 

（2）第二次离子交换层析分离纯化：

a）Source S(XK5030)柱： 柱体积500ml,用A液1000毫升平衡柱子备用;

b）Source S(XK5030)柱纯化： 将步骤（1）得到的神经毒蛋白用A液稀释三倍，流速为10ml/分，直接加入Source S(XK5030)柱中，再用10-35%梯度的A液 B液3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml清洗柱子，按标准纯化图谱收集二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。

2. 根据权利要求1所述的双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法，其特征在于，对蛇毒进行两次离子交换层析纯化，具体步骤如下：

（1）第一次离子交换层析分离纯化：

a）眼镜蛇粗毒的溶解：

配制0.02M的磷酸盐缓冲液，并调pH 5.6—pH 6.8为A液；

配制含0.8M NaCl的A液为B液；

称取眼镜蛇粗毒20-30克，用A液50-100毫升溶解，3000转/分转速，离心8-12分钟，取上清液为蛇毒液，备用；

b）SP-Sephodex-C25凝胶柱分离纯化：

将600毫升SP-Sephodex-C25凝胶用500毫升0.3N NaOH浸泡10分钟，用纯水洗至中性，抽干取出置烧杯中加A液600毫升抽气10分钟，取出装于XK-5030柱中，用A液2000ml平衡，将上述离心好的蛇毒液加入SP-Sephodex-C25凝胶柱中，流速为10ml/分，

用A液600ml进行洗脱，再用15-35%梯度 A液, B液3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml平衡柱子，按标准分离纯化图谱收集一次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白，备用； 

（2）第二次离子交换层析分离纯化：

a）Source S(XK5030)柱： 柱体积500ml,用A液1000毫升平衡柱子备用；

 b）Source S(XK5030)柱纯化： 将步骤（1）得到的神经毒蛋白用A液稀释三倍，流速为10ml/分，直接加入Source S(XK5030)柱中，再用10-35%梯度A液, B液 3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml清洗柱子，按标准纯化图谱收集二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。

3. 根据权利要求1或2所述的双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法制备的制剂，其特征在于，用权利要求1或2得到的二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白与药学上可接受的辅料，通过现有的常规制剂方法制备的单方制剂或复方制剂。

4.根据权利要求3所述的双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的制剂，其特征在于，所述的单方制剂为：包括片剂、胶囊剂、溶液剂或颗粒剂的口服制剂、缓控释剂、靶向制剂、乳膏剂、外用溶液剂、冻干粉注射剂或水针注射剂。

5.根据权利要求3所述的双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的制剂，其特征在于，所述的复方制剂为：包括片剂、胶囊剂、溶液剂或颗粒剂的口服制剂、缓控释剂、靶向制剂、乳膏剂、外用溶液剂、冻干粉注射剂或水针注射剂。