[发明专利]双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法及制剂

说明书

技术领域

本发明属于生物医药的分离纯化领域，涉及一种双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法及制剂。 

背景技术

科博肽是从中华眼镜蛇蛇毒中分离纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。本发明中提及的科博肽就是眼镜蛇神经毒蛋白的通用名。 

科博肽可以通过抑制神经肌肉接头突触后乙酰胆碱与受体的结合而起到镇痛作用。其生物学活性直接影响到镇痛效果，包括镇痛的强度和镇痛的持续时间。 

临床运用证明：科博肽制剂具有良好的镇痛效果，而且镇痛持续时间长；副作用小，安全系数高；特别是没有药物耐受性和依赖性的特点，越来越被广大疼痛患者接受和使用。 

科博肽作为天然来源的生化药物，已经在科技文献、药学研究刊物、杂志上公开和发表了多种多样的分离纯化方法，包含不同程序的组合。但是，对于科博肽的分离纯化，还存在着进一步提高科博肽纯度及实现工业化生产线分离纯化科博肽的问题。 

发明内容

本发明的目的在于为进一步提高眼镜蛇神经毒蛋白纯度，最大限度地保存科博肽的生物学活性，且实现工业化生产线分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白而提供一种双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法及制剂的新的技术方案。 

本发明的技术方案: 双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法，其特征在于，对蛇毒进行两次离子交换层析纯化，步骤如下： 

（1）第一次离子交换层析分离纯化：

a）眼镜蛇粗毒的溶解：

配制0.02M的磷酸盐缓冲液为A液，

配制含0.8M NaCl的A液为B液；

称取眼镜蛇粗毒，用A液溶解，离心取上清液为蛇毒液，备用；

b）SP-Sephodex-C25凝胶柱分离纯化：

将SP-Sephodex-C25凝胶用0.3N NaOH浸泡，用纯水洗至中性，抽干取出置烧杯中加A液抽气，取出装于XK-5030柱中，用A液平衡，将上述离心好的蛇毒液加入SP-Sephodex-C25凝胶柱中，流速为8-12ml/分，用A液进行洗脱，再用15-35%梯度进行梯度洗脱，然后用100% B液(含NaC1的A液)洗脱，最后用A液600ml平衡柱子，按标准分离纯化图谱收集一次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白，备用； 

（2）第二次离子交换层析分离纯化：

a）Source S(XK5030)柱： 柱体积500ml,用A液1000毫升平衡柱子备用;

b）Source S(XK5030)柱纯化： 将步骤（1）得到的神经毒蛋白用A液稀释三倍，流速为10ml/分，直接加入Source S(XK5030)柱中，再用10-35%梯度的A液, B液3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml清洗柱子，按标准纯化图谱收集二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。 

 或采用下述方法对蛇毒进行两次离子交换层析纯化，具体步骤如下： 

（1）第一次离子交换层析分离纯化：

a）眼镜蛇粗毒的溶解：

配制0.02M的磷酸盐缓冲液，并调pH 5.6—pH 6.8为A液；

配制含0.8M NaCl的A液为B液；

称取眼镜蛇粗毒20-30克，用A液50-100毫升溶解，3000转/分转速，离心8-12分钟，取上清液为蛇毒液，备用；

b）SP-Sephodex-C25凝胶柱分离纯化：

将600毫升SP-Sephodex-C25凝胶用500毫升0.3N NaOH浸泡10分钟，用纯水洗至中性，抽干取出置烧杯中加A液600毫升抽气10分钟，取出装于XK-5030柱中，用A液2000ml平衡，将上述离心好的蛇毒液加入SP-Sephodex-C25凝胶柱中，流速为10ml/分，

用A液600ml进行洗脱，再用15-35%梯度 A液, B液3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml平衡柱子，按标准分离纯化图谱收集一次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白，备用； 

（2）第二次离子交换层析分离纯化：

a）Source S(XK5030)柱： 柱体积500ml,用A液1000毫升平衡柱子备用;