[发明专利]一种PCR快速检测大丽轮枝菌的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种PCR快速检测大丽轮枝菌的方法，以大丽轮枝菌DNA为模板进行PCR反应，其特征在于，所述PCR反应体系中加入有一对特异性引物dali1/dali2，该特异性引物的序列分别为：

特异性引物dali1：5’-CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’，

特异性引物dali2：5’-GCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGC-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，所述PCR反应体系为：l0×PCR buffer2μL，15mM MgCl₂ 0.5μL，2.5mM dNTPs1.6μL，5μM引物dali1/dali2各0.5μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.2μL，DNA模板2μL,，灭菌双蒸水12.7μL，终体积为20μL；PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，63℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的方法，所述PCT快速检测为实时荧光定量PCR检测。

4.根据权利要求3所述的方法，所述PCR反应体系中加入有荧光基团SYBR Green Supermix。

5.根据权利要求4所述的方法，所述PCR体系总体积为20μL，SYBR Green Supermix 10μL，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali1，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali2，DNA模板2μL，余量为无菌双蒸水6μL，检测程序为：

第1步:95.0℃运行3分钟，

第2步:95.0℃运行10秒钟，

第3步:57.0℃运行30秒钟，

第4步:运行第2步,重复39次，

第5步:熔解曲线温度65.0℃至95.0℃,每5秒钟增加0.5℃。

6.根据权利要求1所述的方法，所述大丽轮枝菌DNA来自植物组织或土壤。

7.一种检测大丽轮枝菌的试剂盒，包括一PCR反应体系，所述PCR反应体系中含有特异性引物dali1/dali2：

特异性引物dali1：5’-CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’，

特异性引物dali2：5’-GCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGC-3’。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述PCR反应体系还包括荧光基团SYBR Green Supermix。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述PCR反应体系为：SYBR Green Supermix10μL，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali1，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali2，无菌双蒸水6μL；需加入的待测大丽轮枝菌DNA模板2μL。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括标准阳性模板，所述标准阳性模板为大丽轮枝菌菌株DNA经特异性引物dali1/dali2扩增，扩增产物与pGEMT-T Easy载体连接后获得的标准质粒DNA。