[发明专利]一种PCR快速检测大丽轮枝菌的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种PCR快速检测大丽轮枝菌的方法及其试剂盒，专用于检测大丽轮枝菌，属于农作物病害诊断与防治技术领域。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，属于半知菌亚门轮枝菌属真菌。大丽轮枝菌的寄主范围极广，寄主植物至少20科80种，大田作物包括向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等，一般禾本科作物如水稻、麦类、玉米、谷子、高梁等不受侵害。

大丽轮枝菌主要引起作物黄萎病。病原菌的菌丝体、厚垣孢子和微菌核，随病残体在土中越冬。该菌适生性强，寄主广，防治难度大。

病菌主要在土壤里越冬(夏)，且在土壤里存活时间较长，一般是通过土壤、肥料、灌溉水等进行传播，以侵染危害植株地下部位的根茎为主，且能侵染植物的维管束，病原物在维管束里繁殖，阻塞其输送营养物质，在短期内致使整株植物枯萎而死亡。在保护地农作物种植栽培过程中，大丽轮枝菌引致的土传病害的发生更为严重，导致作物产量损失巨大，严重影响了保护地的发展与人民的经济收入。

传统病原菌鉴定方法通常采用选择性培养基进行病原菌的分离培养，菌落形态观察，显微镜下观察病菌的菌丝体，孢子等特征，结合田间发病植株症状的观察进行分类。传统鉴定方法在很多方面存在一定误差和困难，尤其是对土传病原菌的准确鉴定具有很大局限性。仅菌丝体和孢子等的形态特征也即表型分析来鉴别，有时是不准确的。同一病原菌的菌落往往在形态上、分布、生理性状等方面存在一定差异，难以进行准确鉴定。随着分子生物学技术的日益成熟和广泛应用，人们有可能避开传统的分离培养过程，通过DNA水平上的研究，对土壤中病原菌进行鉴定。分子生物学方法的简便、快速、高效、可靠等特点，是传统的分离培养方法所达不到的。

定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术(rea1-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过扩增产物熔解曲线分析可以特异的检测和鉴定某种病原真菌，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域，但在农业植物病原真菌的定性定量检测研究中应用较少，尤其是在大丽轮枝菌的定性定量研究中。

发明内容

本发明的目的在于克服大丽轮枝菌传统检测鉴定方法的不足，提供一种PCR法快速检测大丽轮枝菌的方法。在该方法的基础上，优化荧光定量PCR反应体系，实现对发病植物组织中及土壤中的大丽轮枝菌的快速检测定量，可以试剂盒的形式在植物病害诊断与防治领域大规模推广。

同时提供检测大丽轮枝菌的试剂盒。该试剂盒采用根据大丽轮枝菌ITS区所设计的特异性引物，利用优化的荧光定量PCR反应体系，提高了检测的准确性，节约了检测时间，

一种PCR快速检测大丽轮枝菌的方法，以大丽轮枝菌DNA为模板进行PCR反应，其特征在于，所述PCR反应体系中加入有一对特异性引物dali1/dali2，该特异性引物的序列分别为：

特异性引物dali1：5’-CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’，

特异性引物dali2：5’-GCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGC-3’。

所述PCR反应体系为：l0×PCR buffer2μL，15mM MgCl₂0.5μL，2.5mM dNTPs1.6μL，5μM引物dali1/dali2各0.5μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.2μL，DNA模板2μL,，灭菌双蒸水12.7μL，终体积为20μL；PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，63℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

所述PCT快速检测为实时荧光定量PCR检测。

所述PCR反应体系中加入有荧光基团SYBR Green Supermix。

所述PCR体系总体积为20μL，SYBR Green Supermix10μL，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali1，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali2，DNA模板2μL，余量为无菌双蒸水6μL，检测程序为：

第1步:95.0℃运行3分钟