[发明专利]抗猪圆环病毒2型的表达载体和转基因猪及其构建方法

权利要求书

1.一种抗猪圆环病毒2型的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、用XhoI和EcoRI酶切SEQ ID NO:1的H1启动子和质粒pCyL50，纯化，连接，转化感受态细胞，培养后挑选单克隆菌落进行扩大培养，筛选阳性克隆，酶切鉴定，得到pPB-H1质粒；

(2)、以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3作为模板及引物进行重叠PCR扩增得到序列号为SEQ ID NO:4的pPB-sh2序列，按步骤(1)相同的方法将pPB-sh2序列连接到pPB-H1质粒上，得到序列号为SEQ ID NO:11的shRNA分子pPB-H1-sh2；

(3)、分别以质粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175-CAGGS-EGFP为模板，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，纯化得到neo基因和EGFP；各取10ng-200ng混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo-EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)和neo-EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA3.1-Neo-T2A-EGFP载体；

(4)、以SEQ ID NO:13的质粒为模板，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物，PCR扩增出含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段；按步骤(1)相同的方法将含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段连接到pPB-H1-sh2上，得到抗猪圆环病毒2型的表达载体：pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP，序列号为SEQ ID NO:12。

2.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒2型的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中重叠PCR扩增的程序为：98℃3min；98℃10s，50℃10s，72℃10s；30个循环；72℃10min。

3.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒2型的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述第一次PCR的反应程序为：98℃2min；98℃10s，68℃50s；35个循环；72℃10min；所述第二次PCR的反应程序为：98℃2min；98℃10s；68℃1min40s；35个循环；72℃10min。

4.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒2型的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述PCR扩增的反应程序为：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃3min；35个循环；72℃10min。

5.权利要求1-4任一项所述的构建方法构建得到的抗猪圆环病毒2型的表达载体。

6.一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、将权利要求5所述的表达载体与转座酶质粒mPB混合共转染猪胎儿成纤维细胞系，筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；

(2)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，采用常规育种技术进行培育，即可得到抗猪圆环病毒2型的转基因猪。

7.根据权利要求6所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述共转染的步骤为：

（1）、把表达载体pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB混合加入到1000μL中，混匀；

（2）、加入7μL用前混匀的PLUS^TMReagents，混匀后静置5min；

（3）、加入21μL用前混匀的Lipofectamine^TMLTX，混匀后静置30min；

（4）、用DMEM洗单层细胞1-2次，加入1000μL DMEM，再把上述（3）的混合液左右轻晃混匀，4-6h后换上含有10%胎牛血清的细胞生长培养基，转染48小时。

8.根据权利要求6或7所述的抗猪圆环病毒2型的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述表达载体pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB的摩尔数比为3:1。