[发明专利]抗猪圆环病毒2型的表达载体和转基因猪及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种抗猪圆环病毒2型的表达载体及其构建方法，以及抗猪圆环病毒2型的转基因猪及其构建方法。 

背景技术

猪圆环病毒，属于圆环病毒科，为单股环状DNA病毒，分为1型和2型。其中猪圆环病毒1型（PCV1）不致病，猪圆环病毒2型（PCV2）具有致病性。PCV2基因组为共价闭合、单股环状的DNA分子，大小约为1767或1768个核苷酸。推测PCV2含有11个大小不一的开放性阅读框（Open reading frames,ORFs），其中ORF1、2、3、4、7和8具有一定的同源性，其余则无任何同源性。PCV2编码的ORF1、5、7和10位于基因组DNA链上，5→3顺时针方向相同；ORF2、3、4、6、8、9和11位于互补链上，5→3逆时针方向相同；这些基因组彼此重叠，最大限度利用病毒有限的遗传分子，完成病毒的复制和包装过程。11个ORFs中仅包含两个主要功能性ORFs，分别编码衣壳蛋白（Cap protein,Cap蛋白）和复制酶（Replicase,Rep）蛋白，在病毒的生命周期中起到两个最主要的基本功能，即病毒基因组的复制和连续性包装。Rep蛋白由PCV最大的开放阅读框ORF1编码，与该基因组的滚环复制有关，分子量分别为35.6kDa（PCV1）或35.8kDa（PCV2）。PCV1 和PCV2比较，Rep蛋白氨基酸序列同源性达86%，这也是2种血清型PCV产生抗原交叉性的主要原因。若PCV2中复制必需的rep和rep’基因发生突变，可降低病毒DNA的复制，同时使病毒蛋白的合成减少90%以上。ORF2基因编码的Cap蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白和最主要的免疫原性蛋白。研究表明，ORF2可以用来区分PCV1与PCV2，通过合成肽分析免疫相关区域，发现病毒ORF2的25～43aa和169～187aa是两型PCV之间的两个共同的抗原表位。PCV2与PCV1Cap蛋白之间虽然具有共同的抗原表位，但不存在交叉反应。经多肽扫描分析，Cap蛋白N-末端第65～87aa，113～139aa、157～183aa和193～207aa为PCV2特异性的抗原位点 

在养猪业疾病防控中，疫苗是人们用来对付疾病的最常用手段。而由于圆环病毒灭活疫苗与亚单位疫苗成本高、注射次数多和容易造成机体应激等缺点，以及免疫效力有待提高，并不能大规模的免疫接种。在我国销售进口PCV2疫苗单一头份价格最高达48元人民币，而国产灭活疫苗价格也在10元人民币左右。绝大多数养猪户是无法承受为单一疾病的预防而花费如此的价格购买疫苗的。另外，虽然疫苗的使用在控制由PCV2感染而引起PMWS中获得了一些成功，但是这种综合征的发病病源是多样的，而且在其它综合征上并没有突破，所以，从其他途径寻找解决这个问题的方法显得更有必要。 

RNAi（RNA interference,RNAi），又称反义RNA(anti-sense RNA)，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi技术可以防 止病毒入侵、抑制病毒复制、减少病毒RNA数量、阻断病毒蛋白的表达，在抗病毒感染领域具有较大的潜力。 

随着转基因技术的发展，培育转基因品种已成为可能。目前，常规育种技术在实现猪杂种优势利用、性能测定、遗传评估及优良品种培育方面取得了显著成就，但其选择周期长、遗传进展慢等问题一直是培育突破性新品种的“技术瓶颈”。随着动物基因组学、蛋白组学、分子标记辅助选择和动物转基因等生物技术的迅猛发展，猪种质资源创新和新品种培育已进入了一个新的发展时期。在这一时期，研究和开发猪品种培育新技术，建立起优质、高效、环保型及无公害等重要功能基因高效克隆、基因转化、新品种快速扩繁等的技术体系，是猪新品种培育并建立现代健康养猪业的前提条件。通过转基因操作改良性状的生物技术育种方法，直接针对育种目标，目的性强、周期短，可以同时改良重要经济性状。因此，转基因育种是培育抗病型猪种的关键新技术，也切实可行。