[发明专利]一种检测特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的方法

权利要求书

1.一种检测特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：

（1）取含有整合了人胰岛素基因的pZRHi-1质粒的大肠杆菌发酵液，进行组织破碎，得到破碎液；

（2）将步骤（1）得到的破碎液超滤，得到宿主细胞总蛋白；

（3）将步骤（2）得到的宿主细胞总蛋白对家兔进行皮下注射免疫；

（4）取免疫后的家兔血清，采用G蛋白亲和色谱柱进行纯化，得到纯化血清抗体；

（5）使人胰岛素与CNBr活化的Sepharose4Fastflow色谱柱填料偶联，处理后得到人胰岛素亲和色谱柱；

（6）将步骤（4）得到的纯化血清抗体通过步骤（5）制得的人胰岛素亲和色谱柱进行纯化，制得特异性抗体；

（7）将步骤（6）得到的特异性抗体用辣根过氧化物酶标记，得酶标抗体；

（8）按照双抗体夹心法对待测样品进行测定，得到待测样品大肠杆菌残留宿主蛋白的含量。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的含有整合了人胰岛素基因的pZRHi-1质粒的大肠杆菌通过以下方法得到：

A、获得人胰岛素基因：合成人胰岛素原基因序列，且该人胰岛素原基因序列包含一个5′Cla I和一个3′Hind III位点；

B、将人胰岛素原基因导入质粒进行基因重组：用Cla I和Hind III限制性内切酶将pZRHi-1质粒和人胰岛素原基因分别切开，再用DNA连接酶将所述基因与质粒连接，得到能表达出人胰岛素基因的重组质粒；

C、将重组质粒导入到受体细胞中：向大肠杆菌的培养液中加入氯化钙或硫酸镁，再加入步骤B得到的重组质粒，经培养得到含有整合了人胰岛素基因的pZRHi-1质粒的大肠杆菌。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤A为用固相亚磷酰胺法合成人胰岛素原基因序列。

4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤B具体为：分别向pZRHi-1质粒和包含一个5′Cla I和一个3′Hind III位点的人胰岛素原基因中加入Cla I和Hind III限制性内切酶，在35-39℃作用1小时，然后在60-65℃下保持10-15分钟终止反应；将两份反应液混合后加入DNA连接酶，14-18℃下反应10-12小时，得到能表达出人胰岛素基因的重组质粒。

5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤C具体为：向大肠杆菌的培养液中加入氯化钙或硫酸镁，再加入步骤B得到的重组质粒，置0-4℃冰浴25-35分钟，然后置40-45℃水浴80-100秒，再置0-4℃冰浴1-2分钟，最后置35-39℃水浴3-5分钟，即可得到含有整合了人胰岛素基因的pZRHi-1质粒的大肠杆菌。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）为将破碎液用8-12k超滤膜进行超滤，得到宿主细胞总蛋白。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（5）具体为：

Ⅰ、将CNBr活化的Sepharose4Fastflow与预冷的0.5～1.5mM HCl溶液混合，充分溶胀，装柱后用预冷的0.5～1.5mM HCl溶液冲洗，再以pH8.3的0.2M NaHCO₃与0.5M NaCl的混合溶液冲洗，得到预处理Sepharose4Fastflow；

Ⅱ、将1～2mg/ml的人胰岛素水溶液在pH8.3的0.2M NaHCO₃与0.5M NaCl混合溶液中透析；

Ⅲ、将预处理Sepharose4Fastflow与透析过的人胰岛素水溶液在室温下混合2～6小时后重新装柱，用pH8.3的0.2M NaHCO₃与0.5M NaCl混合溶液冲洗，得到偶联Sepharose4Fastflow；

Ⅳ、将偶联Sepharose4Fastflow加入到pH8.0的0.2M Gly溶液中，混合1～5小时；重新装柱后分别以pH8.3的0.2M NaHCO₃与0.5M NaCl混合溶液和pH4.0的0.1M NaAc与0.5M NaCl的混合溶液冲洗，得到人胰岛素亲和色谱柱。