[发明专利]一种检测特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的检测方法，特别是用于检测通化东宝药业股份有限公司生产的工艺特异性的重组人胰岛素的大肠杆菌残留宿主蛋白含量。

背景技术

重组人胰岛素（recombinant human insulin,以下简称RHI）自1982年美国FDA批准上市以来，便在全球范围内广泛应用于II型糖尿病的临床治疗。RHI通常是利用大肠杆菌工程菌来制备，正如其它重组蛋白一样，宿主蛋白在产品中有残留几乎是不可避免的，从而对产品造成污染。这些残留宿主蛋白在血液中的累计浓度达到100ppm时，很可能会刺激人的免疫系统引起免疫反应，从而影响药物的疗效。

目前临床应用的RHI产品是由多个不同厂家生产的，而不同厂家的生产工艺不尽相同，例如，我单位（通化东宝药业股份有限公司）采用整合了人胰岛素基因的pZRHi-1质粒的大肠杆菌进行发酵生产RHI（甘舒霖牌重组人胰岛素），该工艺具有发酵时间短、适合大批量生产、产品纯化过程简单及生产成本低等优点。不同厂家制备工艺上的差异造成RHI产品中残留宿主蛋白构成的不同。但当前用于RHI产品大肠杆菌残留宿主蛋白检测的通常是ELISA试剂盒，该试剂盒在制备抗体时所采用的抗原是普通大肠杆菌，所以在检测特异工艺RHI产品的残留宿主蛋白时，特异性低，灵敏度差，测定结果不能真实地反应出产品中残留宿主蛋白的含量，即便检测结果显示合格，也不能充分说明其安全。另外，截止目前，普通测定方法（如，高效液相法等）都不适用于具有工艺特异性的RHI中残留宿主蛋白的检测。

因此，提供一种灵敏度高、特异性强且重复性好的特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的检测方法，以便准确地测出残留宿主蛋白含量尤为重要，不但可以保证生物制品的安全性，也可作为生产过程中质量控制和工艺优化的重要参数。

我单位自1998年开始上市销售甘舒霖牌重组人胰岛素，填补了国内空白，目前已在临床上广泛应用，每年销售额10亿以上。随着生物药的发展和人们对该类药物的了解，生物药的安全问题越来越引起人们的重视。我单位以为病患提供更为安全、有效的药品为宗旨，因此，发明人针对我单位RHI产品的特异性工艺，研究得到本发明的检测大肠杆菌残留宿主蛋白含量的方法，主要用于该RHI成品及其生产过程中残留宿主蛋白的实时检测，也可为其它基因工程产品残留宿主蛋白检测技术提供借鉴。

发明内容

针对上述问题与不足，本发明提供一种特异性检测我单位RHI产品中大肠杆菌残留宿主蛋白含量的方法，该方法灵敏度高、特异性强、重复性好，以该检测方法控制舒霖牌重组人胰岛素的质量，能有效提高产品的安全性，保证其有效性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种检测特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的方法，该检测方法包括以下步骤：

（1）取含有整合了人胰岛素基因的pZRHi-1质粒的大肠杆菌发酵液，进行组织破碎，得到破碎液；

（2）将步骤（1）得到的破碎液超滤，得到宿主细胞总蛋白；

（3）将步骤（2）得到的宿主细胞总蛋白对家兔进行皮下注射免疫；

（4）取免疫后的家兔血清，采用G蛋白亲和色谱柱进行纯化，得到纯化血清抗体；

（5）使人胰岛素与CNBr活化的Sepharose4Fastflow色谱柱填料偶联，处理后得到人胰岛素亲和色谱柱；

（6）将步骤（4）得到的纯化血清抗体通过步骤（5）制得的人胰岛素亲和色谱柱进行纯化，制得特异性抗体；

（7）将步骤（6）得到的特异性抗体用辣根过氧化物酶标记，得酶标抗体；

（8）按照双抗体夹心法对待测样品进行测定，得到待测样品的大肠杆菌残留宿主蛋白含量。

本发明的技术方案是以整合了人胰岛素基因的pZRHi-1质粒的大肠杆菌发酵液破碎、超滤制备的宿主总蛋白作为抗原，刺激家兔产生抗体，继而采用固定了人胰岛素的亲和色谱法祛除其中人胰岛素抗体，制备特异性抗体，对其采用辣根过氧化物酶标记后采用双抗体夹心法检测待测样品中的残留宿主蛋白。