[发明专利]一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法

权利要求书

1.一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，其特征在于它包括以下步骤： 

(1)将海水鲆鲽鱼类受精卵置于甲醛-戊二醛固定液中室温抚育3-6 小时，直接用磷酸吐温缓冲溶液置换相应                                                体积的甲醛-戊二醛固定液，并于4℃保存，待用；

(2)在解剖镜下挑选出发育状态较正常的受精卵，并用解剖针将胚盘从整个受精卵中剥离出来；

(3)用Triton-100对样品进行打孔处理，再用NaBH₄溶液抚育样品三次，每次不超过半小时； 

(4)采用改进的间接免疫荧光标记方法步骤对样品进行标记，间接免疫荧光标记的基本步骤为：封闭→抚育一抗→清洗→抚育二抗→清洗，具体过程如下：

封闭：在室温下用封闭液对样本封闭处理1-2小时，所述封闭液为PBS+0.1% Tween-20+1%DMSO+10%山羊血清；

抚育一抗：先用抗体稀释液将单克隆鼠抗α-微管蛋白进行稀释制成一抗悬浮液，然后将封闭后的样品在一抗悬浮液中4℃抚育过夜，所述抗体稀释液为含有浓度百分比为10%的山羊血清和5%的二甲亚砜（DMSO）的Tris盐酸缓冲液；

清洗：将样品用清洗液清洗3-4次，每次10分钟，所述清洗液为PBS+0.1%Tween-20；

抚育二抗：用所述抗体稀释液将Alexa Fluor 555标记的山羊抗小鼠IgG进行稀释，制成二抗抚育液，同时加入DNA荧光染料DAPI，然后在避光条件下将样品室温抚育0.5-1小时，

再用清洗液清洗5-6次，每次10分钟；

(5)制作胚胎整装片，用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜进行观察拍照。

2.根据权利要求1所述的一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，其特征在于：所述步骤中固定的受精卵未进行去膜处理。

3.根据权利要求1所述的一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，其特征在于：所述步骤中使用的甲醛-戊二醛固定液配方为：80 mM K-PIPES, 5 mM EGTA, 100 mM MgCl₂, 400 mM NaCl，3.7%甲醛、0.25%戊二醛和0.5%Triton X-100。

4.根据权利要求1所述的一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，其特征在于：所述步骤中磷酸吐温缓冲溶液的成分为：128 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM NaH₂PO₄, 2 mM KH₂PO₄, 0.1% Tween-20, pH 7.2。

5.根据权利要求1所述的一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，其特征在于：所述步骤中用Triton-100对样品进行打孔处理的温度为25-30℃，浓度为4-5%，处理时间为10-12小时。

6.根据权利要求1所述的一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，其特征在于：所述步骤中NaBH₄溶液为50%乙醇配制的2.5mg/L溶液。

7.根据权利要求1所述的一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，其特征在于：所述步骤(4)中用抗体稀释液将单克隆鼠抗α-微管蛋白进行稀释，稀释比例为1：500-1000。

8.根据权利要求1所述的一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，其特征在于：所述步骤中用抗体稀释液将Alexa Fluor 555标记的山羊抗小鼠IgG进行稀释的比例为1：250-500；加入的DNA荧光染料中DAPI占总体积的比例为1：10000-100000。

9.根据权利要求1所述的一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，其特征在于：所述步骤中制作胚胎整装片时加入抗荧光淬灭剂，使荧光信号更强，保存时间更持久。