[发明专利]一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫细胞化学技术和荧光显微技术，具体涉及一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法。

背景技术

免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原结合对抗原进行专一定位测定的技术。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。因此，该技术是将免疫学中抗原、抗体以及补体间专一性反应结合显微或亚显微组织学的一些研究方法的统称，是免疫学原理与光镜或电镜技术的结合。荧光显微技术是利用特异性的荧光染料与细胞内特定成分结合后能够呈现一定颜色的荧光，然后在荧光显微镜下观察该细胞成分在细胞中的定位与分布情况。荧光双标记显微观察技术是指利用荧光标记技术同时标记细胞内两种生物大分子的技术方法。荧光双标记显微观察技术在卵细胞骨架和细胞核方面的应用研究在哺乳动物方面较多，主要集中于鼠、猪、兔等。在果蝇和爪蟾(Xenopus)方面也有相关报道。在海洋生物卵细胞骨架和细胞核方面的应用主要集中于海胆、海参、和对虾等方面。荧光双标记显微观察技术在鱼类卵细胞骨架和细胞核方面的应用研究较少，目前仅见青蒋（Abraham等，1995）和斑马鱼 （Suresh等，1996；KarenW.Lee等 ,2004；Robin E. Lindeman 等，2012）等淡水鱼，在海水鱼卵细胞骨架和细胞核方面的应用研究至今未见报道。

由于受精卵微管蛋白分子的免疫荧光标记技术是利用抗原-抗体特异性反应来进行的，所以该标记技术在卵细胞方面的应用，均需先将卵膜去掉，以便于相应的微管蛋白大分子抗体进入卵细胞内部与相应抗原结合，再进行标记和显微观察。上述已报道的利用荧光双标记显微观察技术研究受精卵细胞骨架和细胞核的相关研究均为先将卵膜去掉，再进行固定、荧光标记和显微观察。海水鲆鲽鱼类受精后，原生质在受精卵动物极形成较扁且薄的圆盘状胚盘，原生质较致密；而且受精膜薄而坚韧，其与卵黄膜之间的卵周隙窄小几乎不可见。很难将活着的海水鲆鲽鱼类受精卵的受精膜去掉，再将去膜的受精卵进行固定。因此，已报道的常规均黄受精卵（哺乳动物）早期胚胎发育过程中微管蛋白和DNA的荧光双标记显微观察技术方法在海水鲆鲽鱼类受精卵方面的应用受到限制，需要建立一种海水鲆鲽鱼类受精卵早期胚胎发育过程中微管蛋白和DNA的荧光双标记显微观察方法。

发明内容

针对上述荧光双标记显微观察技术在海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核方面的应用限制，本发明提供了一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，该方法是先用固定液对样品进行固定，再在普通解剖镜下挑选出发育状态较正常的受精卵，用尖头镊子将胚盘从整个受精卵中剥离出来，然后再进行打孔、封闭和荧光双标记，最后用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察拍照。  

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法，它包括以下步骤： 

(1)将海水鲆鲽鱼类受精卵置于甲醛-戊二醛固定液中室温抚育3-6 小时，直接用磷酸吐温缓冲溶液置换相应                                                体积的甲醛-戊二醛固定液，并于4℃保存，待用；

(2)在解剖镜下挑选出发育状态较正常的受精卵，并用解剖针将胚盘从整个受精卵中剥离出来；

(3)用Triton-100对样品进行打孔处理，再用NaBH₄溶液抚育样品三次，每次不超过半小时； 

(4)采用改进的间接免疫荧光标记方法步骤对样品进行标记，间接免疫荧光标记的基本步骤为：封闭→抚育一抗→清洗→抚育二抗→清洗，具体过程如下：

封闭：在室温下用封闭液对样本封闭处理1-2小时，所述封闭液为PBS+0.1% Tween-20+1%DMSO+10%山羊血清；

抚育一抗：先用抗体稀释液将单克隆鼠抗α-微管蛋白进行稀释制成一抗悬浮液，然后将封闭后的样品在一抗悬浮液中4℃抚育过夜，所述抗体稀释液为含有浓度百分比为10%的山羊血清和5%的二甲亚砜（DMSO）的Tris盐酸缓冲液；

清洗：将样品用清洗液清洗3-4次，每次10分钟，所述清洗液为PBS+0.1%Tween-20；

抚育二抗：用所述抗体稀释液将Alexa Fluor 555标记的山羊抗小鼠IgG进行稀释，制成二抗抚育液，同时加入DNA荧光染料DAPI，然后在避光条件下将样品室温抚育0.5-1小时，