[发明专利]高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株的宿主菌为黑曲霉（Aspergillus niger），该基因工程菌株包含α-葡萄糖转苷酶基因表达盒。

2.根据权利要求1所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌，其特征在于：所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶基因的来源为黑曲霉。

3.根据权利要求1所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌，其特征在于：所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中含有糖化酶启动子、糖化酶信号肽、α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因和色氨酸终止子。

4.根据权利要求1所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌，其特征在于：所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因的N-末端融合了糖化酶信号肽。 

5.一种如权利要求1至4任一项所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：

⑴根据GenBank中已报道的糖化酶启动子序列为依据，设计引物，以黑曲霉基因组DNA为模板扩增糖化酶启动子序列；

⑵根据GenBank中已报道的α-葡萄糖转苷酶mRNA序列、糖化酶信号肽序列为依据，设计引物，以黑曲霉总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到含有糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶的成熟肽基因；

⑶根据GenBank中已报道的色氨酸终止子序列为依据，设计引物，以质粒pBI-hph为模板扩增得到色氨酸终止子序列；

⑷将步骤⑴中糖化酶启动子序列、步骤⑵中α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因和步骤⑶中色氨酸终止子序列经酶切后依次与载体pT-Z连接，构建完整的α-葡萄糖转苷酶基因表达盒，随后将其插入到pBI-hph的Hind III和Xba I位点之间，鉴定正确后，获得双元载体为pBI-Glu；

⑸双元载体pBI-Glu转化到农杆菌LBA4404中，利用农杆菌阳性克隆子对黑曲霉进行介导转化，构建基因工程菌，黑曲霉转化子经鉴定正确后，测定黑曲霉转化子的产α-葡萄糖转苷酶的活力，筛选产酶活力比出发菌株活力提高了4.0~12.1倍的菌株即得高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤⑷的具体步骤为：

糖化酶启动子序列的PCR产物经Kpn I与Nco I酶切后，切胶回收该启动子片段，插入经连接酶连接pUCm-T 质粒后形成的闭合环状的pT-Z质粒的Kpn I与Nco I位点之间，获得重组质粒pT-P；

PCR扩增的色氨酸终止子序列电泳回收后，用Xba I与BgI II进行酶切回收并连接到同样酶切的pT-P质粒的相应位点上，获得重组质粒pT-P-C；

把连接到T载体上含有糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因利用BgI II与Nco I酶切并电泳回收后，插入到pT-P-C质粒的BgI II与Nco I位点之间，获得重组质粒pT-P-α-C；

质粒pT-P-α-C经Hind III/Xba I双酶切，获得α-葡萄糖转苷酶基因表达盒，将该基因片段插入质粒pBI-hph的Hind III和Xba I位点之间，构建双元载体pBI-Glu。

7.根据权利要求5或6任一项所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌经发酵所测粗酶液酶活力比出发菌株酶活力提高了12.1倍。