[发明专利]高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，尤其是一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株及其构建方法。

背景技术

α-葡萄糖转苷酶（α-transglucosidase，EC 2.4.1.24），又称α-葡萄糖苷酶、转移葡萄糖苷酶，它可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基转移到另一个糖类底物形成α-1，6糖苷键，从而得到非发酵性的功能低聚异麦芽糖（IMO）、糖脂或糖肽等。α-葡萄糖转苷酶是一种重要的工业用酶，在食品、饲料、化工、医药等领域显示了广阔的应用前景，特别是在IMO生产中的巨大应用潜力早已引起国内外食品工业界的重视。

目前，我国还没有规模化生产α-葡萄糖转苷酶的能力，工业上所用的α-葡萄糖转苷酶主要依赖于进口，价格昂贵。国内关于α-葡萄糖转苷酶的研究也主要集中于产α-葡萄糖转苷酶菌株的筛选、诱变及培养条件优化等方面，效果均不太理想，诱变株的稳定性较差，酶产量还是偏低，并且难以纯化。近几年来，随着基因工程技术的迅猛发展，构建和利用基因工程菌作为大规模生产α-葡萄糖转苷酶的宿主，进一步提高酶活及酶的产量，降低生产成本，成为研究该酶制剂的一种新途径，并在世界范围内得到越来越广泛的重视及应用。1997年，Akira N等从黑曲霉工业菌株GN-3中克隆出α-葡萄糖转苷酶基因，并将该基因引入到Emericella nidulans中表达，表达量为0.96 U/mg蛋白。1999年，Galichet A等从Thermococcus hydrothermalis AL662菌株中，通过建立基因文库，克隆了α-葡萄糖转苷酶基因，将该基因克隆到Sulfolobus solfataricus突变株TCY70 中，但其表达量较低。2001年，Martino A等以硫磺矿硫化叶菌MT-4总DNA为模板，通过PCR将α-葡萄糖转苷酶基因克隆到E. coli中表达，其表达量达到87.5 U/g 湿菌体。2004年，苏艳利用大肠杆菌表达系统表达黑曲霉α-葡萄糖转苷酶基因，经IPTG诱导，酶活高达226.8 U/mL。2008年，杨捷琳等从阪崎肠杆菌中克隆α-葡萄糖苷酶基因，重组到pET22b（+）质粒在大肠杆菌中进行表达及活性研究，目标蛋白量约占菌体总蛋白量的18%。2009年，童星等以毕赤酵母KM71为宿主菌表达黑曲霉SG136 α-葡萄糖转苷酶基因，并对表达产物的转苷活性进行测定，制备的粗酶液在最适pH和温度下反应24 h时，低聚异麦芽糖的总含量达到最大为26.0%。

我国关于α-葡萄糖转苷酶的研究起步较晚，为了改变依赖于进口这一现状，寻求一条国产化的道路，本发明利用基因工程技术构建基因工程菌株，进一步提高酶的产量及活性，为其工业化生产奠定基础。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种增加了α-葡萄糖转苷酶基因的拷贝数，有效提高了酶的表达量，为其工业化生产奠定了基础的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌及其构建方法，该构建方法易于操作、方法简单，而且可以构建含有不同基因拷贝数和在基因组位置不同的工程菌。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌为黑曲霉（Aspergillus niger），该基因工程菌株包含α-葡萄糖转苷酶基因表达盒。

而且，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶基因的来源为黑曲霉。

而且，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中含有糖化酶启动子、糖化酶信号肽、α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因和色氨酸终止子。

而且，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因的N-末端融合了糖化酶信号肽。 

如上所述的高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下：

⑴根据GenBank中已报道的糖化酶启动子序列为依据，设计引物，以黑曲霉基因组DNA为模板扩增糖化酶启动子序列；

⑵根据GenBank中已报道的α-葡萄糖转苷酶mRNA序列、糖化酶信号肽序列为依据，设计引物，以黑曲霉总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到含有糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶的成熟肽基因；

⑶根据GenBank中已报道的色氨酸终止子序列为依据，设计引物，以质粒pBI-hph为模板扩增得到色氨酸终止子序列；