[发明专利]一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种含RBE顺式元件、正负筛选元件的人凝血因子IX表达框架的质粒，记为pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml，其特征在于该质粒含有一个由CMV启动子RBE元件TK1基因组成的筛选标记；其序列为SEQ ID NO.5所示。

2.一种如权利要求1所述的含RBE顺式元件、正负筛选元件的人凝血因子IX表达框架的质粒的构建方法，其特征在于具体步骤为：

（1）构建pCMV-TK1重组质粒

将合成的携带XbaI和AflⅡ粘性末端的TK1基因DNA片段，通过DNA重组技术插入经XbaI和AflⅡ双酶切的pcNDA3.1(-)/myc-His A载体，获得pCMV-TK1质粒；TK1基因DNA片段见SEQID NO.1所示；

（2）扩增“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”片段

以质粒pCMV-TK1为模板，用含Nhe I-RBE的上游引物和含Sal I的下游引物扩增获得Nhe I-RBE-TK1-BGHpA-Sal I DNA片段；所述上游引物为SEQ ID NO.2所示，所述下游引物为SEQ ID NO.3所示；

（3）构建pN2-EF1α-hFIXml重组质粒

合成含启动子EF1α的人凝血因子FIX小基因的DNA片段，其5’端增加KpnI粘性酶切位点，在3’端增加NotI粘性酶切位点；合成的携带KpnI和NotI粘性末端的hFIXml双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经KpnI和NotI双酶切的pEGFP-N2，得到重组质粒，记为pN2-EF1α-hFIXml；

（4）构建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒

“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经NheⅠ和SalⅠ双酶切的pN2-EF1α-hFIXml重组质粒，获得表达质粒，记为pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml，其序列为SEQ ID NO.5所示。

3.如权利要求1所述的质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml在建立hFIX基因定点整合系统修饰细胞系中的应用，其特征在于具体步骤为：

（1）构建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS

pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒用Apl I消化，补平后连接获得pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS质粒，用于在MCS位点插入重组基因；

（2）建立hFIX基因定点整合系统修饰细胞系

合成的hFIX表达质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml和pRC质粒共同转染原代培养的成细胞，使用阿昔洛韦和G418共同筛选，得到hFIX基因定点整合系统修饰细胞系。