[发明专利]一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明属生物技术领域，具体为一种质粒pCMV‑RBE‑TK1‑N2‑EF1α‑hFIXml及其构建方法和应用。该质粒含CMV启动子‑RBE元件‑TK1基因的筛选标记的人凝血因子IX表达框架。该质粒和rep表达质粒共转染哺乳动物细胞可用于构建定点整合于AAVS1位点表达人类凝血因子IX的稳定细胞。使用该表达质粒制备稳定表达人类凝血因子IX的稳定细胞一方面正负双重筛选可以防止细胞随机突变导致的非整合细胞耐药对转基因细胞群纯净度的影响，提高表达效率；另一方面可以有效预防插入突变导致的基因突变和癌蛋白表达风险。通过常规分子生物学方法取代人类凝血因子IX表达框架可以构建表达其它基因的具有定点整合以及正负筛选的质粒。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒的构建方法和应用。

背景技术

自然界有许多天然的转基因事件，其中有一些事件在进化历程中被证明是安全的。在人类基因组有大量转座子的痕迹和转座子的作用位点。但是，人类基因组最具有意义的是19号染色体有一个AAV病毒的整合位点AAVS1（adeno-associated virus integrationsite1），其为基因组中AAV病毒基因组的整合位点（Future Virol. 2010 Sep 1;5(5):555-574.）。自然情况下，AAV仅仅整合在AAVS1；在离体选择条件下，超过75%的AAV ITR（inverted terminal repeat）附加的基因可以在rep蛋白指导下整合在AAVS1.

到目前为止我们已知AAV感染不与任何疾病相关，并且最近的研究发现AAV感染的细胞具有一定的抗病毒感染和抗肿瘤发生特性。重要的是这种结论是以成年人大于90%的AAV感染率为前提得出的，具有高度可靠性。

Rep蛋白和介导整合的顺式元件，位于AAV ITR或位于P5启动子内的16bp RBE（repbinding element），已经得到较为深刻的研究，可以构成可靠的定点整合转基因系统（HumGene Ther. 2010 ;21(6):728-38. Gene Ther. 2009 ;16(5):589-95. J Mol Biol.2006 ;358(1):38-45.）。

发明内容

本发明的目的在于提高一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用。

本发明提供的pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒，含RBE顺式元件、正负筛选元件的人凝血因子IX表达框架。具体的，该质粒含有一个由CMV启动子RBE元件TK1基因的筛选标记；RBE元件TK1基因的筛选标记序列采用常规分子生物学方法制备，并插入pN2-EF1α-hFIXml质粒的位点Kpn I和Not I之间，得到pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒，其序列见SEQ.ID.NO5所示。

pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒和rep表达质粒pRC（J. Mol. Biol. 2006;385:38-45）共转染哺乳动物细胞，可用于构建定点整合于AAVS1位点表达人类凝血因子IX的稳定细胞。携带有RBE顺式元件可以介导rep蛋白依赖的AAVS1位点整合；Neo正筛选基因可以用G418筛选获获得整合细胞；RBE元件位于TK1基因和启动子之间，用阿昔洛韦筛选可去除没有RBE参与的非定点整合细胞；最后获得定点整合于AAVS1位点稳定表达人凝血因子IX的细胞。

本发明提出的pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒的构建方法，具体步骤为：

(1）构建pCMV-TK1重组质粒