[发明专利]鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用

权利要求书

1.鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒，其特征在于：所述鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的鸡鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale YN12091，菌株保藏号是：CCTCC No：M2013318，简称ORT），该试剂盒包含有ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清，其中所述ORT血凝抗原是通过筛选ORT高血凝活性菌株，培养、洗涤制备；所述醛化绵羊红细胞是通过采集绵羊血液，洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制备；所述ORT标准阳性血清是通过ORT菌悬液三次免疫健康鸡，第3次免疫后采集血液，离心制备。

2.一种鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步骤为：

制作ORT血凝抗原：将鸡鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale YN12091，菌株保藏号是：CCTCC No：M2013318，简称ORT）云南分离株YN12091（菌株保藏号是：CCTCC No：M2013318），菌种接种于营养琼脂培养基，筛选ORT高血凝活性菌株，通过培养、洗涤制备ORT血凝抗原；

制作醛化绵羊红细胞：采集绵羊血液，通过洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制备醛化绵羊红细胞；

制作ORT标准阳性血清：通过ORT菌悬液三次免疫健康鸡，第三次免疫后采集血液，离心制备ORT标准阳性血清；

将上述制备的ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清组装建立鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的操作步骤即血凝抑制试验方法步骤为：

（1）根据血凝试验结果配制4单位抗原：

以能引起100%血凝的ORT血凝抗原最高稀释倍数代表1个血凝单位，4单位抗原的的配制方法如下：试剂盒提供的ORT血凝效价为1:1024，则4单位抗原的稀释倍数应是1:256，其中1024/4=256，稀释时，将20μL抗原加入到5 mL PBS中即为4单位抗原，但是，该4单位抗原必须经过验证后才可确定其实际稀释倍数，用于血凝抑制效价的测定；

4单位抗原的验证方法即血凝试验方法：取96孔V形微量反应板（为了便于以下描述96孔板中每个孔的具体位置，将96孔V形微量反应板的8行分别命名为A～H行，12列分别命名为1～12列；如：第1行的第5列孔，则表示为A5孔；第2行的第6列孔，则表示为B6孔）；

 A.用移液器在A1～A6孔各加入25 μL PBS；

B. 吸取25 μL ORT血凝抗原加入到A1孔中，吹打3～5次充分混匀；

C. 从A1孔中吸取25 μL混匀后的抗原液加到A2孔中，混匀后吸取25μL加入到A3孔中，依次进行系列倍比稀释至A4孔，最后从A4孔各吸取25 μL弃之，A5和A6孔为红细胞对照；

D. 自右向左依次向A6～A1孔中加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液；

E. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温20～25℃静置60 min后观察结果，在醛化红细胞对照孔即A5和A6孔出现完全沉淀的情况下，其1×单位抗原孔(A2孔)的红血球必须达到100%凝集，同时0.5×单位抗原孔（A3孔）醛化红细胞达到50%凝集50%下沉孔底才符合要求，否则重新调配；

（2） 取96孔V形微量反应板，用移液器在A1～A11孔各加入25 μL PBS，A12孔加入50 μL PBS；

（3） 在A1孔加入25 μL被检血清或1/2倍稀释的卵黄液（取鸡蛋，将蛋壳敲出1小孔暴露卵黄，用不带针头的注射器吸取卵黄2 mL于玻璃瓶中，再加入2mL生理盐水，混匀即为1/2倍稀释的卵黄液），充分混匀后吸取25 μL加至A2孔，依次类推，倍比稀释至A10孔，最后从A10孔各吸取25 μL弃之，设A11孔为ORT抗原对照，A12孔为醛化红细胞对照；

（4） 在第A1～A11孔各加入25 μL 4单位抗原，置微量振荡器上160转/分钟震荡1分钟，使反应物混合均匀，室温静置30 min；

（5） 自右向左依次向A12～A1孔加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液；

（6） 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温静置60 min后观察结果，在醛化红细胞对照出现完全沉淀、ORT抗原对照出现完全凝集的情况下，以完全抑制醛化红细胞凝集的血清或卵黄最大稀释倍数判为该血清或卵黄的血凝抑制效价，当被检血清或卵黄抗体效价大于等于16即4log2，判为ORT抗体阳性。