[发明专利]鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用，鼻气管鸟杆菌YN12091（Ornithobacterium rhinotracheale YN12091，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国 武汉 武汉大学；保藏日期2013年7月6日；菌株保藏号是：CCTCC No.：M2013318，简称ORT），血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用，特别是检测鸡鼻气管鸟杆菌血清抗体和卵黄抗体水平的半定量检测试剂盒。 

背景技术

鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium  rhinotracheale  YN12091，简称ORT）是新命名的一种以家禽和野禽呼吸道疾病相关的病原体，ORT感染的主要症状为生长迟缓、死亡率增高、产蛋减少。肺炎，胸膜炎和气囊炎是本病的主要病理特征，该病呈世界分布，ORT可能引起原发性或继发性感染，其死亡率通常为1%～15%，协同感染和继发感染其它病菌时死亡率增加，在大部分严重感染的情况下，其死亡率高达50%，该病给养禽业带来巨大的经济损失。 

ORT感染的血清学鉴定和免疫状况的评估均需检测血清或卵黄中的ORT抗体。 

现有进口的鼻气管鸟疫杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒只能检测鸡和火鸡血清中ORT抗体，在大规模检测和免疫状况监测时需要进行大批鸡只进行采血，容易造成应激影响鸡的生产；另外，该进口试剂盒不能检测卵黄中的ORT抗体，且价格昂贵使其大规模应用受到一定的限制。 

发明内容

本发明目的在于克服上述现有进口ORT间接ELISA抗体检测试剂盒不能检测鸡卵黄中ORT抗体的不足，发明一种鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒。该试剂盒不仅能对鸡血清中的ORT抗体进行检测，而且能对鸡卵黄中卵黄抗体进行检测。 

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒包含有ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清，其中所述ORT血凝抗原是通过筛选ORT高血凝活性菌株，培养、洗涤制备；所述醛化绵羊红细胞是通过采集绵羊血液，洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并 用鞣酸鞣化制备；所述ORT标准阳性血清是通过ORT菌悬液3次免疫健康鸡，第3次免疫后采集血液，离心制备。 

一种鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步骤为： 

制作ORT血凝抗原：筛选ORT高血凝活性菌株，通过培养、洗涤制备ORT血凝抗原； 

制作醛化绵羊红细胞：采集绵羊血液，通过洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制备醛化绵羊红细胞； 

制作ORT标准阳性血清：通过ORT菌悬液三次免疫健康鸡，第三次免疫后采集血液，离心制备ORT标准阳性血清； 

将上述制备的ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清组装建立鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒。 

所述鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的操作步骤即血凝抑制试验方法步骤为： 

（1）根据血凝试验结果配制4单位抗原： 

以能引起100%血凝的ORT血凝抗原最高稀释倍数代表1个血凝单位，4单位抗原的的配制方法如下：试剂盒提供的ORT血凝效价为1:1024，则4单位抗原的稀释倍数应是1:256，其中1024/4=256，稀释时，将20μL抗原加入到5 mL PBS中即为4单位抗原。但是，该4单位抗原必须经过验证后才可确定其实际稀释倍数，用于血凝抑制效价的测定； 

4单位抗原的验证方法即血凝试验方法：取96孔V形微量反应板（为了便于以下描述96孔板中每个孔的具体位置，将96孔V形微量反应板的8行分别命名为A～H行，12列分别命名为1～12列。如：第1行的第5列孔，则表示为A5孔；第2行的第6列孔，则表示为B6孔。）； 

 A.用移液器在A1～A6孔各加入25 μL PBS； 

B. 吸取25 μL ORT血凝抗原加入到A1孔中，吹打3～5次充分混匀； 

C. 从A1孔中吸取25 μL混匀后的抗原液加到A2孔中，混匀后吸取25μL加入到A3孔中，依次进行系列倍比稀释至A4孔，最后从A4孔各吸取25 μL弃之，A5和A6孔为红细胞对照； 

D. 自右向左依次向A6～A1孔中加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液；