[发明专利]抗体表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达载体的构建方法，具体涉及一种抗体表达载体的构建方法。

背景技术

近年来，治疗性抗体的研发取得了突破性的进展，使得治疗性人单抗的研制成为生物技术领域的热点。大容量抗体库是制备人单抗的重要技术平台，一个具有良好多样性的大容量噬菌体抗体库可以提供有效的获取各种人源抗体的可靠手段。但构建性能良好的大容量抗体库具有很高难度，需采取更好的技术路线并具备性能优越的表达载体。在抗体库技术应用过程中，人们认识到以下因素对抗体库的构建至关重要，首先由于细菌转化效率的限制，达到10⁹以上的库容需很大的工作量，为决这一难题，有人提出了利用loxp-cre定位重组系统构建大容量抗体库的技术，因此需要适用于此系统的载体，而且不同的抗体基因在大肠杆菌的本底表达对细菌的生长有不同的毒性作用，影响细菌的生长，从而使抗体库在扩增过程中多样性越来越差，此外，在克隆抗体基因的过程中，如选用的限制性内切酶不当，也可因将抗体基因切断而影响抗体库的多样性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出了一种抗体表达载体的构建方法，不但能够保证抗体库大的库容量，并且避免了抗体库扩增过程中的多样性丧失。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种抗体表达载体的构建方法，在将表达载体p3MH改造为PAL过程中，使用两种DNA操作，其特征在于，包括以下步骤：

(1)表达载体的构建；

(2)噬菌体的制备和滴定；

(3)抗体基因的细胞内重组；

(4)酶联免疫吸附剂测定。

进一步，所述表达载体p3MH为本实验室在pCOMB3H的基础上改造而成。

进一步，所述步骤(1)具体包括：在载体中插入人工合成的寡核苷酸和通过PCR介导的定位突变改造载体中的特定序列。

进一步，所述步骤(2)具体包括：挑选含有适当载体的单集落XL1-BLUE菌，接种到含氨苄青霉素和葡萄糖的培养基中。

进一步，所述步骤(3)具体包括：挑选单集落BS1365菌，在含有卡那霉素和葡萄糖的培养液中生长至对数增长期，通过稀释铺盘计数每毫升所含细菌数，将两种噬菌体混合。

进一步，所述步骤(4)具体包括：将HbsAg用碳酸盐溶液稀释，搁置12小时，假如待测噬菌体样本，在37度下孵育一小时，加OPD底物显色，读取A490值。

进一步，PCR介导的定位突变的操作步骤为：设计合成含有预期突变序列和适当限制性内切酶消化后，与相同内切酶消化的载体常规连接，连接物转化感受态细菌，铺盘选单集落提取质粒，用内切酶分析鉴定正确。

本发明提出了一种抗体表达载体的构建方法，不但能够保证抗体库大的库容量，并且避免了抗体库扩增过程中的多样性丧失。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是载体改造所合成的中药引物列表；

图2是p3MH和pAL载体的比较示意图；

图3是pAL的内切酶图谱鉴定图；

图4是pALHB所表达的噬菌体抗体的ELLSA检测结果。

图5是pALHBK和pALHBHA在GS1365菌中的重组结果。

图中数字和字母所表示的相应部件名称：

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明提高了一种抗体表达载体的构建方法，在将表达载体p3MH改造为PAL过程中，使用两种DNA操作，包括以下步骤：

(1)表达载体的构建；

(2)噬菌体的制备和滴定；

(3)抗体基因的细胞内重组；

(4)酶联免疫吸附剂测定。